专题5DNA和蛋白质技术课题3血红蛋白的提取和分离(二)教案.pptVIP

二、实验操作 血液 血浆 水 分 固体物质： 血浆蛋白、无机盐、磷脂、葡萄糖等 血细 胞 白细胞 血小板 红细胞 （最多） 血红蛋白 （90％） （一）血红蛋白 血红蛋白 两个α－肽链 两个β一肽链 四个亚铁血红素基团 每个肽链环绕一个亚铁血红素基团，此基团可携带一分子氧或一分子二氧化碳，血红蛋白因含有血红素而呈红色。 （一）血红蛋白 二、实验操作 用鸡的红细胞提取DNA，用猪、牛、羊的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？ 鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取；人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富，便于提取血红蛋白。 样品处理→粗分离→纯化→纯度鉴定 蛋白质提取和分离步骤 （二）操作过程 (1)红细胞的洗涤: ②洗涤目的: 去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的 分离纯化。 ①洗涤操作： 1、采集血样。 2、低速短时间离心。 3、吸取血浆：上层透明的黄色血浆。 4、盐水洗涤：用五倍体积的质量分数为0.9％的氯化钠溶液洗涤。 5、低速短时间离心。 6、重复4、5步骤三次，直至上清液中已没有黄色，表明洗涤干净。 1.样品处理 （二）操作过程 洗涤次数过少，无法除去血浆蛋白； 离心速度过高、时间过长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀，达不到分离的效果。 注意： (2)血红蛋白的释放：加蒸馏水到原血液体积，再加40％体积的甲苯 ，置于磁力搅拌器上充分搅拌10分钟（加速细胞破裂）,细胞破裂释放出血红蛋白。 (3)分离血红蛋白溶液： ①离心：将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度离心10 min。 ②试管中溶液层次： 第1层（最上层）：甲苯层（无色透明）； 第2层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（白色）； 第3层（中下层）：血红蛋白的水溶液层（红色)； 第4层（最下层）：杂质沉淀层（暗红色）。 ③分离：用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。 (4)透 析： ①过程：取1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/l的磷酸缓冲液中（pH为7.0），透析12小时。 ②透析目的：除去样品中分子量较小的杂质。 2. 粗分离 2.凝胶色谱操作: （1）凝胶色谱柱的制作： ①取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。②底塞的制作：打孔→挖出凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端。注意事项：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。③顶塞的制作：打孔→安装玻璃管。④组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。⑤安装其他附属结构。 ①凝胶的选择： A、材料：交联葡聚糖凝胶（G-75）。 B、代表意义：“G”表示凝胶的交联程度，膨胀程度及分离范围。75表示凝胶的得水值，即每克凝胶膨胀时吸水7.5克。 ②凝胶的前处理：配置凝胶悬浮液：计算并称取一定量的凝胶浸泡于蒸馏水或洗脱液中充分溶胀后，配成凝胶悬浮液。 （2）凝胶色谱柱的装填 ③凝胶色谱柱的装填： A、固定：将色谱柱装置固定在支架上。 B、装填：将凝胶悬浮液一次性缓慢倒入色谱柱内，装填时轻轻敲动色谱柱，使凝胶填装均匀。 注意： 1、凝胶装填时尽量紧密，以降低凝胶颗粒之间的空隙。 2、装填凝胶柱时不得有气泡存在：因为气泡会搅乱洗脱液中蛋白质的洗脱次序，降低分离效果。 （2）凝胶色谱柱的装填 ④洗涤平衡：装填完毕后，立即用缓冲液洗脱瓶，在50cm高的操作压下，用300ml的20mmol/l的磷酸缓冲液（pH为7.0）充分洗涤平衡12小时。 注意： 50cm高 （2）凝胶色谱柱的装填 1、液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。 2、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。 （3）样品加入与洗脱 ①调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。 ②滴加透析样品：吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。 ③样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口 ④洗脱：小心加入pH=7.0 的20mmol/l的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。 ⑤收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5ml收集一试管，连续收集。 注意：正确的加样操作是：1、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。 在分离过程中，如果红色区带均匀一致