腺病毒介导HB载体表达双靶位shRNA抑制HBV转基因小鼠体内HBV表达的研究.pdfVIP

牛文摘要 因小鼠体内HBV表达的研究 摘 要 目的：慢性乙型病毒性肝炎是我国的常见病，迄今尚无 满意疗法。基因疗法为乙型肝炎提供了新的治疗策略。RNA 干扰(RNA 致靶基因的表达沉默，产生相应的功能表型缺失的现象。 B RNAi针对乙型肝炎病毒(Hepatitisvirus，HBV)基因具有强 效的沉默功能，但尚缺乏理想的向细胞内转运的工具，本研 HBV为之提供包装，分泌抗HBV的HBV样颗粒，实现导 向型及放大效应，有望为发展特异性的抗HBV基因治疗提 供新的技术平台。 方法：应用AdMax。M腺病毒载体系统，将HBV载体表 入腺病毒载体，构建了重组腺病毒Ad．CH．sh68及对照载体 Ad—CH．RFP2，转染293细胞，大量扩增后用氯化铯密度梯度 纯化法纯化，测重组腺病毒滴度。后将重组腺病毒感染HBV 转基因小鼠，30只HBV转基因小鼠随机分为3组：实验组、 阴性对照组和空白对照组，每组分别为10只。实验组小鼠 经尾静脉注射Ad-CH．sh68，阴性对照组经尾静脉注射 Ad-CH-RFP2，空白对照组注射生理盐水。感染重组腺病毒 中文摘要 Fluorescent 病毒蛋白定量检测，免疫组织化学检测HBV特定蛋白的表 达，荧光定量PCR检测HBV-DNA，还同时检测了组织病理 学变化。将治疗组和阴性对照组小鼠血清中提取HBV-DNA， 做PCR扩增观察体内是否形成重组HBV。 结果： (viralparticles，vp)／mL。 2重组腺病毒经尾静脉感染HBV转基因小鼠后，小鼠一般 情况良好，在实验期问均未出现死亡。实验组和阴性对照组 小鼠肝脏病理HE染色结果显示感染腺病毒后12天肝细胞出 现轻度肿胀，局部有淋巴细胞浸润，后恢复正常。 3阴性对照组小鼠在感染Ad．CH．RFP2后4天肝脏为粉红色， 冰冻切片观察RFP表达量结果显示重组腺病毒能有效感染 HBV转基因小鼠，感染后4天大部分的肝细胞表达RFP，随 时间推移荧光表达量下降。 4 组小鼠血清提取DNA后，经荧光定量PCR检测，结果显示 HBV特定蛋白表达的抑制。与空白对照组相比差别有显著意 中文摘要 阴性对照组与空白对照组相比无意义。治疗组20天与0天 相比差别有意义(pO．001)，阴性对照组、空白对照组均无意 义(pO．05)。 5 B surface 果。注射重组腺病毒AD．HBV-sh68后，在治疗不同时间定 量检Nd,鼠血清中的HBsAg，结果发现在感染后4天开始下 降，至20天降于一低水平表达，抑制率为67．39％。腺病毒 的转染率和HBsAg半衰期较长对抑制率也有影响。与空白 对照组相比差别有显著意义(P0．001)，与阴性对照组相比差 别也有显著意义(P0．001)，阴性对照组与空白对照组相比无 对照组、空白对照组均无意义(p0．05)。 6 Bcore (hepatitis HBcAg主要呈核浆型分布，少部分在胞浆内表达。空白对照 组HBV转基因小鼠肝细胞胞核内有大量棕褐色颗粒 (HBsAg)，阴性对照组小鼠内棕色颗粒数较空白对照组略有 下降，治疗组小鼠在感染重组腺病毒4、12天时棕色颗粒数 所占比例明显降低，感染20天体内只有少量棕色颗粒表达。 天只有很少的阳性颗粒表达，阴性对照组较空白对照组略有 下降。 7HBV转基因小鼠体内重组HBV形成：HBV转基因小鼠血 中文摘要 清PCR结果证明了HBV载体在野生型HBV辅助下能够形 成重组HBV，且随着载体质粒比例的增大，重组载体也增加。 结论：本研究应用腺病毒载体转导HBV载体表达 shRNA，经尾静脉注射感染HBV转基因小鼠，实验结果表 明shRNA能有效且较长时间的抑制小鼠体内HBV基因的复 制和表达。尽管把HBV载体插入腺病毒载体，利用腺病毒 感染HBV转基因小鼠，能有效的将shRNA转入小鼠肝脏细 胞中，但走向临床，仍需不断的全方面研究。总之，本研究 结果为R