农杆菌介导新城病毒lasota株hn基因在苜蓿表达研究.pdf

捅要 农杆菌介导新城疫病毒Lasota株HN基因 在苜蓿表达研究 预防兽医硕士研究生：胡拥军 指导老师：王豪举玉永雄 摘要 新城疫(ND)由新城疫病毒Omv)引起，该病传播迅速，发病率和死亡率都在95％以上， 常给养鸡业造成了巨大的经济损失。NDV的HN糖蛋白具有良好的免疫原性，已经在痘病毒、 杆状病毒和大肠杆菌等载体系统中获得表达。随着基因生物技术的迅速发展，利用植物生产 转基因蛋白成为了研究热点，而苜蓿作为一种生物反应器，具有操作方便、可规模化生产等 优势。将NDV的FIN基因导入苜蓿中表达后饲喂鸡群，既有可能使动物机体产生ND抗体， 增强免疫力，又可提供营养、改善畜禽产品品质。因此，其潜在应用前景非常良好。 1．重组质粒pBll21-HN的稳定性 Km 取菌种农杆菌菌株LBA4404接种于YEB液体培养基中复苏，然后转接于含S0mg／L 的YEB培养基中选择培养。为了检测重组质粒pBIl21-HN的稳定性，取对数生长期中的农 杆菌LBA4404培养物离心洗涤，提取质粒DNA，并进行酶切和FCR鉴定。结果酶切和PCR 扩增均得到了预期目的条带，表明重组质粒pBIl21-HN在农杆菌LBA4404中稳定。 2．转化中抗生素及其浓度的筛选 选取青霉素类和头孢菌素类几种抗生素，对农杆菌菌株LBA4404进行药敏试验：将西农 15号苜蓿叶片接种子含Cef培养基中，观察苜蓿愈伤组织形成情况。结果浓度为400mg／L的 Cef完全能抑制农杆菌LBA4404的生长；Cef对西农15号苜蓿叶片出愈影响不大，浓度范围 在200400mg／L时愈伤组织诱导率为79．84％，与对照组无显著差别。表明农杆菌菌株 LBA4404对头孢噻肟钠(Cef)敏感，故我们选用浓度为400mg／L的Cef作为脱菌剂。 以苜蓿总DNA为模板扩增NPT．II基因的735bp片段，检测西农15号苜蓿对卡那霉素 (Kin)的内源抗性。结果未能获得目的条带，表明西农15号苜蓿不存在Km抗性基因，可 以作为转化材料。 以西农15号苜蓿叶片为外植体，经不同的处理，然后转入含KmSH培养基中。观察愈 MS0培 伤组织形成及分化成胚状体的情况，统计诱导率和分化率；将愈伤组织接种于含Kin 养基中，观察胚状体形成的情况，统计分化率。结果：不经过预培养处理，叶片在IOn浓度达 到40mg／L时，出愈率仅为8％，分化率也仅为2％，抑制作用明显；黑暗下预培养3天，叶 Km浓度下诱导率和分化率较高，分别为68％和46％，其它浓度下诱导率及其 片在10mg／L 分化率都比较低，与对照组相比；光照下预培养3天，叶片在Km各浓度下诱导率较高，均 Kin培养基中所形成愈伤组织的分化能力较强，分化率达到54％， 在58％以上，在10mg／L Km培养基中所形成愈伤组织的分化能力较低，分化率仅为6％：当Km浓度在 但在40mg／L 10．80mg／L的范围内时，黑暗或光照下预培养8天叶片的诱导率均比较高，但分化率随Km Km浓度下所形成的愈伤组织大部分不能继续分化；愈 浓度升高而显著下降，在超过40mg／L 西南大学硕士学位论文 伤组织在Km浓度超过20mg／L时。分化率随浓度升高而迅速下降，当Km浓度达到50mg／L 时，基本不分化。以上结果表明：Km对脱分化和再分化期细胞作用强烈，能显著抑制愈伤 组织形成和胚状体萌发，对分裂期细胞作用缓慢，不能显著降低叶片的出愈率，但明显减弱 所得愈伤组织后期分化成胚状体的能力，在转化中浓度为40mg／L的Km对转化体作用30天 能够筛选出转化体。 3，新城疫病毒Lasota株HN基因的转化与鉴定 通过农杆菌介导，将重组质粒pall21-HN中的HN基因整合到西农15号莒蓿DNA中。 并用40mg／L的Km作用30天对转化体进行