人孕酮受体激素合区基因的表达、复性及活性检测.pdf

人孕酮受体激素结合区基因的表达、复性及活性检测 摘要 为了获得大量人孕酮受体激素结合区(LBD)的表达产物，本实验利用质粒 子(P。。)之后，在终止子前加上一段编码6个HiS的DNA片段，构成PUPR质粒， 转入大肠杆菌后，获得含PUPR质粒的菌株。当用诱导剂诱导时，P。。的抑制解 除，便能启动目的基因的转录和蛋白质合成。 本实验首先研究了培养条件对表达量的影响。(共选择了诱导时间、诱导剂 浓度、培养液中青霉素浓度、培养温度、培养液的PH值五种因素作为研究对象。 结果发现目的蛋白的最佳表达条件为：培养液中PH7．0—7．6、青霉紊浓度为 测时发现．最适反应条件下的产物与不加IPTG，诱导温度为30。c时相比，明显 多一条带，结合SDS—PAGE的电泳图谱，可知目的蛋白的分子量约为45KD，目的 蛋白实际为c端融合蛋白。r’ 本实验接着进行了旦鲍i嚣启的摘解性及龇的研究。溶菌酶溶解菌体发现 目的蛋白主要存在于沉淀中，即以包涵体形式存在。将沉淀溶于5—7M盐酸胍变 性液中(含20mmol／LTris—HCl(Ph8．0)，Immol／LEDTA)，取上清液用Ni柱纯 化，SDS电泳得到一条单一的谱带，含量为70Itg。j、 本实验最后研究了目的蛋白的复性及活性检测。f采用了以下四种方法进行 复性：(1)空气氧化法：(2)氧化一还原谷胱甘肽法： (3)TEA法：(4)L—arg 辅助法。用比色法测定蛋白质浓度，然后进行RLAB检测，并以睾酮与雌二醇作 对照。实验结果发现：几种复性方法均可使孕酮受体LBD片段与Pa的结合率升 高，其中空气氧化法复性效果最差，L—arg辅助法复性效率最好，结合率为 38。05％，同时还发现孕酮受体LBD片段与睾酮、雌二醇受体之间有一定的交叉 结合性。r…m 、， ，7 、／ 一7 关键词t人孕酮受体激素结合区。 表达 wostorn印迹 复性 放射配基结合分析矿 and ofLBD Expressing，RefoldingBioactivity Detecting ‘ ofhPR Segments Tutor：Zhang jiahua Postgraduade：Wang xianzhong h to more studied order effectsof acquireexpressingproduct，we inducer concentrationof inthe concentration、 ampicilin、PHculture、inducing to time resultshowsthatthe condition express．The temperature、inducing optional PH ofInducer