人内皮抑素在家培养细胞和幼虫中表达的研究.pdfVIP

摘要 ／人内皮抑素(Endostatin)是新发现的一种对血管内皮细胞增生宵强烈 L 、 抑湘兀乍用的因子。重组人内皮抑素在动物模型试验中，对忠四科r不同静|l 瘢的小鼠均有明显地抑制肿瘤细胞生长的功效，无任何毒副作用，且反 复用药后也未发现有任何耐药性，显示了其在抗肿瘤临床应用的喜人}m 景。目前人内皮抑素在美国已经进入了I期临床试验。 昆虫杆状病毒表达载体系统(BEVs)是八十年代发展起来的真核表 达系统至今已有上千种来源于不同物种的基因在陔系统中得到高效表 达．而家蚕杆状病毒(BmNPV)表达系统又有其独特的优势。 在本实验中，人内皮抑素cDNA被克隆至转移载体pBacPAK8中， 的修饰型病毒Bm．BacPAKDNA共转染家蚕BmN细胞，然后经空斑纯 毒rBm．BacEndo。 进行生物活性测定，结果表明其对内皮细胞生长的抑制率达到90％以 上。+根据细胞测活结果，粗略估计每瓶细胞表达量为2-3ug左右：后细 胞表达产物经ELISA检测。P／N值达4．3，说明有良好的免疫原性： 带缺失，证实外源基因已成功取代了LacZ基因。再将重组病毒rBm． 测发现第5天表达量最高；取第5天的蚕血淋巴进行内皮细胞测活，抑 制率达到87．3％，与细胞裂解物相比．估算蚕血淋巴中的表达量在约是 家蚕培养细胞中的50倍，达1 00～150ug／头蚕左右。后SDS．PAGE和 Western 关键词：人内皮抑采家蚕?杆状病毒系统?。表达 lI 致谢 本论文垃在导师张耀洲教授的悉心指导下完成的，导师渊博的学 以、严谨f由治学态度、富于丌拓性的思维和果断的工作作风，将使学生 终生受益。值此论文完成之际，谨向导师表示诚挚的感谢。同时，还要 特别感蹦金啦丰副教授在整个实验过程中所给予的指导、关心和启发， 真溅地感驸他为本论文所顷注的心血。 本论文的全部工作均在浙江大学(华家池校区)生物化学研究所完 成的，三年的学习与工作时光飞逝而过，难以忘怀的是生化所老师、同 学的关心与支持。感谢中国农科院镇江蚕业研究所副所长郭锡杰老师， 他在我实验最困难的时候所给予的鼓励和启发：感谢生化所的杜广唏老 师、史锋老师、邵爱萍老师、钱震虹老师、朱健红老师、童官淡老师、 冽家恕老师、陈思义老师、周梅芬老师、黄清祥老师、章骥老师、刘拴 桃老师、周红军老师等在实验中所给予的指导和方便：同时也要感谢苏 州大学的贡成良博士在病毒学方面的指导．以及浙江中奇药业有限公司 的彭崇胜博士、梁大刚先生、毛黎娟女士、徐渊先生、蓝静芬女士、毛 春明先生等的大力支持。 实验的顺利完成离不开生化所己毕业的王晓琳硕士、张益池硕士、 魏然硕士、陆胜明博士、陈学军博士、张曙云博士的无私帮助：也离不 开生化所同窗们的大力支持与合作，他1f]是：于威、朱成钢、黄耀伟、 约翰、杨瑞丽、梁勇等博士生，以及夏学春、金荣仲、朱立成、陈健、 赵秀玲、王莹飞等硕士生，在生化所这样一个团结、互助的群体中，我 感到了大家庭的温暖。 此外，要特别感谓}我的爱人徐晓莉女士、父母亲等在我三年学习中 所给予的关心、支持与鼓励．他1f]的无私付出是难以形容的，唯有不断 地拼搏和进取才能报答他们的亲情。 最后，谨向参加本文评阅、答辩的各位专家致以最诚挚的感谢! 第一章内皮抑素(Endostatin)的研究进展 肿瘤一直足人类难以制服的顽症，直到今天，人类尚缺乏有效的手段 和途径来根治它。传统的治疗手段如：手术、放疗、化疗等虽然能发挥粜 些作用，但由于其副作用大，易导致刷药性等缺点，临床疗效并不理想。 所以人们在不断地寻找新的抗癌途径。 早在七十年代，Folkman等通过实验发现实体肿瘤的生长、转移与其 血管有密切联系：一方面，肿瘤的生长要依赖于血管为其提供养分和养制： 另一方面，血管为肿瘤细胞的转移提供转移通道。据此，他提出抑制肿瘤 血管形成可作为治疗肿瘤的一个新策略。近年来的研究也表明，血管的彤 成是所有实体肿瘤生长和转移的必需条件之一。实体肿瘤形成后即进入无 血管的浸润前期．此时肿瘤细胞主要靠弥散供给营养，这样的肿瘤直径小 于2-3rim，当肿瘤直径生长到1—2mm时，其进一步的生长有赖于血管为其 提供营养。因此切断肿瘤细胞的营养通