杂交与芯片-龙洞班..pptVIP

分子杂交与生物芯片技术 核酸分子杂交技术 概念：具有互补序列的两条核酸单链在一定条件下，按碱基配对原则形成双链的过程。 探针 待测核酸 杂交分子 核酸分子杂交的基本原理 核酸分子杂交的基本方法 探针的标记 核酸分子杂交的基本原理 DNA变性 方法 热变性：90~100℃ 酸碱变性：常采用碱变性 化学试剂变性：尿素、甲酰胺、甲醛等 特点：粘度增加、密度增加、增色效应、溶解温度(melting temperature,Tm) DNA复性或杂交(hybridization) DNA/DNA,DNA/RNA,RNA/RNA等 Equations for calculating Tm 影响杂交的因素 核酸分子的浓度和长度 浓度大，复性快；分子量大，复性慢 温度 离子强度 杂交液中的甲酰胺 核酸分子的复杂性 非特异性杂交反应 预杂交：封闭非特异性杂交位点，用鲑鱼精子DNA 分子杂交的基本方法 Southern 印迹法 Northern 印迹法 斑点印迹杂交 原位杂交 Western 印迹法 液相杂交 Southern 印迹杂交 1975年，英国Southern创建 DNA/DNA杂交，即将DNA电泳、转印到固相支持物上，用探针进行检测的方法。 Southern杂交可用来检测经限制性内切酶切割后的DNA片段中是否存在与探针同源的序列。 Southern 杂交(Southern bloting)的主要步骤 待测DNA样品的制备、酶切 待测DNA 样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳 凝胶中DNA的变性：碱变性 Southern转膜： 硝酸纤维素(NC)膜、尼龙膜 毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法 探针的制备 Southern杂交 杂交结果的检测 Northern 印迹杂交(Northern bloting) 检测RNA（主要是mRNA）的方法 与Southern杂交的不同 靶核酸：RNA RNA电泳 转膜：不需变性 斑点印迹杂交(dot bloting) 将RNA或DNA变性后直接点样于NC膜或尼龙膜上 优点：简单、快速、可同时检测多个样品 它是一种简便、快速、经济的分析DNA或RNA的方法,在基因分析和基因诊断中经常用到,是研究基因表达的有力工具。 但由于目的序列未与非目的序列分离,不能了解目的序列的长度。 尤其当本底干扰较高时,难以区分目的序列信号和干扰信号。 （二）原位杂交 用标记的已知核酸序列为探针，使其与细胞组织或切片中核酸进行杂交检测的方法称为原位杂交。 原位杂交的类型：DNA-DNA、DNA-RNA、RNA-RNA杂交。 特点 能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究 不需从组织或细胞中提取核酸，对含量极低的靶序列灵敏度高 能准确反映组织细胞的相互关系及功能状态 原位杂交的步骤： 取材 ↓ 组织、细胞固定 ↓ 预杂交 ↓ 杂交 ↓ 放射自显影或免疫酶法显色 ↓ 观察结果 染色体原位分子杂交技术 FISH（Chromsome Analysis by Fluorescence in situ Hybridization）的发展为研究染色体上DNA的序列提供了一个最直接的方法。具有经济、安全、快速、稳定，灵敏度高等优点。 多彩FISH可在同一核内显示两种或多种序列，还可对间期核染色体进行研究；应用不同的探针可显示某一物种的全部基因，某一染色体染色片段及单拷贝序列；结合共焦激光显微镜可对间期核及染色体进行三维结构研究，精确检测杂交信号。 食管癌细胞系24色染色体mFISH核型分析 FISH的应用 (1)　基因