酵母菌落PCR.docVIP

酵母菌落PCR方法 酵母菌落PCR方法，酵母菌落PCR方法，涉及提取DNA方法、PCR方法 问：很郁闷，最近在做电转毕赤酵母，但是转化完了没有合适的筛选方法，如果提基组的话费时费钱，而且由我这个电转的几率十分低，也就有1%-10%，所以想用菌落PCR方法筛选，但酵母菌破壁很困难，如果处理不好的话基组释放不出来，就没有阳性结果了。 查了一些资料说用反复冻融法，是不是直接挑单菌落就行了呢？还有说用蜗牛酶帮助消化的，这个我倒不是很清楚，所以请各位大虾们帮帮忙，在实在是被这个伤透脑筋了！ 求助十万火急！！！！！！！ 答：蜗牛酶提取DNA以后作PCR效果很稳定 酵母DNA的提取 1、x新鲜的菌中加入150ul（200ul）bufferiI25 30 ul蜗牛酶（30mg/ml），37度，10Min（可以30min水浴，中间隔5分钟，振荡一次，避免细胞沉到管底。　　2、离心10000rmp，10min，去上清，沉淀中加入bufferII250ul　　3、加入25ul，10%SDS。65度，30min水浴。　　4、加入25ul 5mol/lKAC，冰浴60分钟（4度冰箱放置就可以）　　5、12000rmp，15min，取上清，在上清中加入2-3倍积的无水乙醇，混匀放置－20度一小时（可过夜，取出后不振荡，直接离心）　　6、12000rmp，15min，弃上清。　　7、150ul，bufferIII溶液沉淀，12000rmp，15min　　8、将上清溶液转到干净的离心管中，加入6ul（10ug/ul），ran酶，37度，30min　　9、加入等积异丙醇，4度静止10min，10000rmp，5min，溶50ulbufferIII中　　10、如果有蛋白质可以使用酚氯仿抽提　　11、bufferI：0.9mol/l 山梨醇，0.1mol/l EDTA　　12、bufferII：50mmol/l Tris，20mmol/l EDTA 　　13、bufferIII：10mmol/l tris，1mol/l EDTA　　14、筛选AD/BD可以直接使用抗生素筛选的方法 酵母菌落PCR　　1、酵母质粒和基组DNAPCR模版的备　　取对数生长期酵母菌株1.5ml，13000r/min，离心15s，去上清，双蒸水洗涤一次，13000r/min 离心15s，沉淀悬浮200ulTE缓冲液中，在沸水上煮1-10min，冰浴10min，13000r/min，离心5min，将上清液储存－20度取1ul用PCR　　2、从板上调取长势良好的菌落少许，悬浮含20ul无菌水的0.5ml eppendofff离心管中（离心管中央预先用注射器针头扎一个小孔，放置盖子受热膨胀）水浴煮沸0.2.5.10min　　3、利用微波炉快速备酵母治理以及菌落取直大3mm的酵母干菌落，至EP管中盖上盖子，在微波炉中加热，加入30ulTE振荡，13000r/min，离心2-5min，上清储存浴－20度，取1ul来作PCR 真菌DNA的提取方法改良　　1、酵母活化后加入YEPD培养基，25-28度培养16-24小时，收集菌　　2、取少许新鲜的菌，加入0.6ml缓冲液I（0.9mol/l 山梨醇，0.1mol/l EDTA）1ml。0.1ml蜗牛酶（30mg/ml），37度温浴60min　　3、3000r/min离心10s，去上清，沉淀加入加入bufferII150mmol/l Tris，20mmol/l EDTA 1ml 10%SDS0.1ml65度，30min水浴。　　4、加入0.3ml ，5mol/lKAC冰浴60分钟　　5、10000rmp，15min，取上清，在上清中加入2-3倍积的无水乙醇，混匀放置－20度一小时（可过夜，取出后不振荡，直接离心）在5000-6000r/min离心15s 6、沉淀用0.6ml缓冲液III10mmol/l tris，1mol/l EDTA溶解1000r/min，离心15min　　7、上清液转移一个干净的离心管中，加入6ul10ug/ul），ran酶，37度，30min　　8、加入等积异丙醇，4度静止10min，10000rmp，5min，溶50ulbufferIII中　　9、如果有蛋白质可以使用酚氯仿抽提 后续试验思路　　1、提取酵母DNA　　2、作PCR　　3、筛库的引物（上CTATTCGATGATGAAGATACCCCACCAAACCC 下：GTGAACTTGCGGGGTTTTTCAGTATCTACGATT　　为这个引物的TM值很，所以必须使用二次PCR　　94度，3min，95度，20miao，68度3min，68度7min，15度15min　　修改序94度，3min，95度，25miao，