蛋白质及氨基酸的测定36687.pptVIP

三、双缩脲法 1原理 在碱性条件下，铜离子和多肽 至少有两个肽键，如双缩脲、多肽和所有的蛋白质 生成的复合物呈紫红色，吸收波长为560nm，比色所得的吸光度值和样品中蛋白质的含量成正比。 2测定方法 1 5mL双缩脲试剂和1mL蛋白质溶液 1~10mg蛋白质／mL 混匀。试剂包括硫酸铜、氢氧化钠和酒石酸钾钠以及稳定在碱性溶液中的铜离子； 2 混合液在室温下放置15min或30min，然后在560nm处比色，读取吸光度值，并扣去空白； 3 如果反应液不澄清，在测定吸光度前可过滤或离心； 4 用牛血清白蛋白 BSA 建立蛋白质浓度与吸光度的标准曲线。 双缩脲法优点 ①该方法比凯氏定氮法费用低，速度快 可在不到30min的时间内完成 ，是分析蛋白质最简单的方法； ②比福林酚法、紫外吸收法或比浊法更少发生颜色偏离； ③几乎没有物质干扰食品中蛋白质的双缩脲反应； ④不需要测定非多肽或非蛋白质来源的氮。 缺点 ①不如福林酚法灵敏，分析时至少需要2~4mg蛋白质； ②如果存在胆汁素，则吸光度会虚假增加； ③高浓度的胺盐会干扰反应； ④不同蛋白质其最终反应产物的颜色不同，如明胶的双缩脲反应产生红紫色； ⑤如果有高浓度的脂或碳水化合物存在时，最终的反应溶液中可能会呈乳白色； ⑥此方法不是一个测量绝对值的方法，必须用已知浓度的蛋白质 如BSA 或经凯氏定氮法校正。 （四）乙酰丙酮比色法（GB/T 5009.5-2003第二法） §3氨基酸的测定 一、茚三酮比色法 1. 原理 氨基酸在碱性条件下与茚三酮作用生成蓝紫色化合物，其颜色深浅与氨基酸含量成正比，测定反应物的吸光度（λ570nm）可计算出样品中氨基酸含量。 2. 试剂 2%茚三酮 pH8.04磷酸缓冲溶液 氨基酸标准溶液 3.仪器 分光光度计 4. 测定方法 （1）样品处理 称样→加水、活性炭→加热提取→过滤→滤液定容 （2）标准曲线制备与样品测定 标准溶液 200μg/mL 样液 标准或样液体积,ml 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 2.0 加入25mL比色管，加水至4.0ml 加1mL茚三酮 水浴加热15min 迅速冷却，定容至25mL，静置15min 测定吸光度（λ570nm 0 A1 A2 A3 A4 A5 Ai 5. 结果计算 二、氨基酸自动分析仪法 1. 原理 食物蛋白质经盐酸水解成为游离氨基酸，经氨基酸分析仪的离子交换柱分离后，与茚三酮溶液产生颜色反应，再通过分光光度计比色测定氨基酸含量。 2. 试剂 3. 仪器 4. 测定方法 （1）样品处理 匀浆、称样 （2）水解 （3）测定 5. 结果计算 第九章 蛋白质及氨基酸的测定 §9.1 概述 蛋白质是一类存在于所有细胞中含量丰富的成分，除了储备蛋白质外，几乎所有的蛋白质对生物功能和细胞结构都非常重要。 食品中的蛋白质种类非常复杂，其中很多已经被纯化和定性。蛋白质分子质量的变化范围通常为5000~1000000u，它们包括氢、碳、氮、氧和硫等元素，20种常见α-氨基酸是蛋白质的主要构成。 蛋白质可以按照它的成分、结构、生物功能或者溶解特性来分类。如水解简单蛋白质只得到氨基酸，但结合类蛋白质还含有非氨基酸成分。 蛋白质有非常独特的构型，它可被各种变性因素，如热、酸、碱、8mol／L尿素、6mol/L盐酸胍、有机溶剂和去垢剂所改变，其溶解性及功能性也可被变性剂所改变。 蛋白质分析的重要性 1 生物活性测定 一些蛋白质包括酶或酶抑制因子和食品科学与营养有关，例如肉类嫩化中的蛋白酶、水果成熟中的果胶酶以及豆类中的胰蛋白酶抑制因子都是蛋白质。 2 功能性质调查 不同种类食品中的蛋白质都有其独特的食品功能性质，例如小麦面粉中的麦醇溶蛋白和麦谷蛋白具有成面团性，牛乳中的酪蛋白在干酪制作中具有凝结作用，而鸡蛋卵清蛋白具有起泡能力。 3 营养标签 ①总蛋白质含量； ②氨基酸组成； ③混合物中的特定蛋白质的含量； ④蛋白质分离纯化过程中的蛋白质含量； ⑤非蛋白氮； ⑥蛋白质的营养价值 消化率、蛋白质功效比或氮平衡 。 食品中蛋白质的含量 食品种类 蛋白质的百分含量 食品种类 蛋白质的百分含量 大米 糙米 大米 白米 小麦粉 整粒 玉米粉 整粒 意大利面条 玉米淀粉 7.9 7.1 13.7 6.9 12.8 0.3 大豆 成熟、生） 豆 腰子状、生 豆腐 生、坚硬 豆腐 生、普通 36.5 23.6 15.8 8.1 乳制品 牛乳 全脂，液体 牛乳 脱脂、干 切达干酪 酸奶 普通的、低脂 水果和蔬菜 苹果 生、带皮 芦笋 生 草莓 生 莴苣 冰、生 土豆 整粒、肉和皮 3.3 36.2 2