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酵母双杂交技术及其在蛋白质组研究中的应用 １.蛋白质组的概述 ２.酵母双杂交系统　 ３.酵母双杂交在蛋白质组学中的应用 （1）.产生背景 基因组研究自从开展以来已经取得了举世瞩目的成就。在过去几年中, 已经陆续完成了包括大肠杆菌、酿酒酵母等十多种结构比较简单的生物的基因组DNA的全序列分析。规模更为庞大的人类基因组计划在2005年完成全部基因组DNA的序列分析。但是也随之产生了新问题。 大量涌出的新基因数据迫使我们不得不考虑这些基因编码的蛋白质有什么功能这个问题。 不仅如此, 在细胞合成蛋白质之后, 这些蛋白质往往还要经历翻译后的加工修饰。 也就是说, 一个基因对应的不是一种蛋白质而可能是几种甚至是数十种。 包容了数千甚至数万种蛋白质的细胞是如何运转的？或者说这些蛋白质在细胞内是怎样工作、如何相互作用、相互协调的？这些问题远不是基因组研究所能回答得了的。 正是在此背景下, 蛋白质组学 proteomics 应运而生。 （2）蛋白组简介 蛋白质组 proteome 一词是马克.威尔金斯 Marc Wilkins 最先提出来的, 最早见诸于1995年7月“Electrophoresis”杂志上, 它是指一个有机体的全部蛋白质组成及其活动方式。 当前蛋白质组学的主要内容是, 在建立和发展蛋白质组研究的技术方法的同时, 进行蛋白质组分析。 对蛋白质组的分析工作大致有两个方面： 一方面, 通过二维凝胶电泳得到正常生理条件下的机体、组织或细胞的全部蛋白质的图谱, 相关数据将作为待检测机体、组织或细胞的二维参考图谱和数据库。 一系列这样的二维参考图谱和数据库已经建立并且可通过联网检索。 二维参考图谱建立的意义在于为进一步的分析工作提供基础。 蛋白质组分析的另一方面, 是比较分析在变化了的生理条件下蛋白质所发生的变化。 如蛋白质表达量的变化, 翻译后修饰的变化, 或者可能的条件下分析蛋白质在亚细胞水平上的定位的改变等。 3 蛋白质组学过程 2.酵母双杂交系统 2.1 双杂交系统的原理 2.2 Sos恢复系统 2.3 优点及局限 2.1 双杂交系统原理 酵母双杂交技术是1989年由Fields等最先应的。与其他技术相比，它省去了耗时耗力的蛋白表达纯化以及抗体制备步骤，并且可以用于高通量的筛选，因此以其简便、快捷与廉价的优点迅速发展成为一种常用的研究蛋白质相互作用的方法。根据对文献的统计，目前已知的蛋白质相互作用至少有一半是通过酵母双杂交实验发现的。 以Fields等人建立的酵母杂交系统为例 Fields 等人的工作标志双杂交系统的正式建立。他们以与调控SUC2 基因有关的2 个蛋白质Snf1 和Snf2 为模型,将前者与GaL4 的DB 结构域融合,另外一个与Ga14 的AD 结构域的酸性区域融合。由DB和AD 形成的融合蛋白现在一般分别称之为“诱饵” bait 和“猎物”或靶蛋白。如果在Snf1 和Snf2 之间存在相互作用,那么分别位于这2个融合蛋白上的DB 和AD 就能重新形成有活性的转录激活因子,从而激活相应基因的转录与表达。这个被激活的、能显示“诱饵”和“猎物”相互作用的基因称之为报道基因 reporter gene 。通过对报道基因表达产物的检测,反过来可判别作为“诱饵”和“猎物”的2 个蛋白质之间是否存在相互作用。在此基础上Fields 等人采用编码β- 半乳糖苷酶的LacZ作为报道基因,并且在该基因的上游调控区引入受GaL4 蛋白调控的GAL1 序列。这个改造过的LacZ 基因被整合到酵母染色体URA3 位上。而酵母的GAL4 基因和GAL80 基因 GaL80 是GaL4 的负调控因子 被缺失,从而排除了细胞内源调控因子的影响。已经知道在Snf1 和Snf2 之间存在相互作用。结果发现只有同时转化了Snf1 和Snf2 融合表达载体的酵母细胞才有β- 半乳糖苷酶活性,单独转化其中任何一个载体都不能检测出β- 半乳糖苷酶活性。 酵母双杂交系统的实验基本过程 Sos恢复系统 原理： 正常情况下，当有生长信号刺激的时候，酵母的Ras鸟苷酸交换因子Cdc25会富集到细胞膜上；这时Cdc25 能够促使Ras蛋白的GDP与GTP的交换，启动下游的信号，促进酵母细胞的生长。在酵母温度敏感缺陷株CDC25-2中，Cdc25 由于突变丧失了上述功能，使得此菌株只能在25摄氏度下生长，而在限制温度37摄氏度无法生长。Sos 是哺乳动物细胞中的Ras 鸟苷酸交换因子，与酵母的Ras 鸟苷酸交换因子Cdc25 同源；研究发现人Sos 能够替代酵母Cdc25，使酵母细胞存活和增殖。于是在酵母温度敏感缺陷株Cdc25-2 中，当人的Sos 与膜定位信号（肉豆蔻酰化或法呢酯化信号）融合后，就会富集到细胞膜上，从而以不依赖配体的方式