酪氨酸酶基因工程菌产黑色素的发酵条件研究.pdfVIP

维普资讯 中 国医药 丁 世杂 志 Chinese 生物技术 丁 fp～lL 酪氨酸酶基因工程菌产黑色素的发酵条件研究 了＆ 伸 c 王戈林 宁 华 萍 彭珍 荣 摘要 研 究 r表达 酪氪酸酶 的基 因工程苗 E．co WY8 产 黑色素 的条件 。WY8能在酪素平板上 产生可溶性 黑色素 ．在添加 酪彝酸 的液体 LB培养基 中的黑色素产率是基 因来源苗 Pseudomonas rnaltophilta的 5倍 。用正交试驻法批 到适 宜发酵产 黑色素 的培养基 ．对摇瓶装量 、菌龄 、底物浓度 、 发酵温度和 pH 等 因素 的影 响怍 r进 一步探讨 。 ． ． ． ． ~flN翌 坚坚塑三 籼冲f 黑色素 melanin 是一类有着复杂结构、 LBf培养基 ：蛋 白胨 1，氯化钠 0．6， 非均 质的类 多酚聚合体 ，能作 为紫外线 吸收 牛 肉膏 0．6；pH7．0。 剂 、抗氧化剂和新型 的天然 的药物载体 ]；用 基础发酵培养基 F ：硫酸铵 0．1，磷 来治疗某些与黑色素缺乏有关 的神经 系统疾 酸氢 二钾 0．7，磷 酸 二氢钾 0．3氯化钠 0．1， 病 ，如着色性 干皮病 、帕金森 氏症 、老年性痴 硫酸镁 0．O1+葡萄糖 0．5．pH7．0。 呆症 、亨廷 氏舞蹈病等 ；具有体外 抗 HIV 酪素培养基 ：蛋 白胨 1，氯化钠0．5， 病 毒0一的作用 ：于扰 HIV 诱导 的台胞体 的形 葡萄糖 0．1一千酪素 0．5，氯化钙 0．01．I酪氨 成 ．阻止 HIV—l被膜表 面的糖 蛋 白和T 细胞 酸 0．2一PH7-0 特异单抗与淋巴母 细胞的结台 。因此 ．它在 医 1-3 试剂 疗 ．食 品和化妆 品工业 中的应用潜力巨大 目 黑色素标准品 Sigma公司 L·酪氲酸 武汉^学生物 前，黑色素的生产主要用提取法和氧化合成 嚣 法 +工 艺繁琐 。近年 ，人们 开始利用 酪氨酸酶 荆为化学纯或分析纯 的氧 化特 性 进 行微 生物 发 酵 法 生 产 黑 色 1 ． 4 方 法 素 酪氨酸酶普遍存 在于链霉菌 中 +却 只 1．4．1 摇 瓶 发酵 ：用 250ml三角瓶 装 发酵 有 很少几种 细 菌具有产 黑色 素 的特 性 + 培养基 ，WY8的 LB培养 液 以 1：20的 比例 搜 们将 嗜麦 芽假 单胞 菌 Ps．eudomo~asreal一 接种 。根据各实验 的 目的，培养条件 、底物 酪 tophilia 的酪氨酸 酶基 因用重 组 DNA 技 术 氨酸加入 时间和浓度有所不 同。 转人 E-coliHBI．0]中，获得表达酪氢酸酶 的 1．4．2 黑色素 的测定 ：按文献 [8]的方法，将 工程菌WY8。本文报道该菌 以I 酪氨酸为底 发酵液离心 ，取上清液用 721型分光光度计测 物生产 黑色 素的条件研 究 。 得 400nm 处 的A 值 ．黑色素 的含量 g／I 1 材料和方法 A × 1／k ×N 其 中 表示黑色素标准 1-1 菌种 曲线的斜率 ，为 0．0095+N 表示稀释倍数 工程 菌 wY8：E．coil重 组体 +所 含的重 2 结果 组质粒携有 Pseudomonasma#ophilia的酪氨 2．1 wY8在 酪素平 板和 液体 LB培 养基 中 酸酶基 因+由我实验 室构 建 。 产黑色素 的情况 1．2 培养基 我们 用重 组 DNA 技 术 获得 酪氢酸 酶基 维普资讯 囤匿药 堂莹查 蔓 ! 』 !J ￡ !II】 l!l!! ! 困工程菌 ：酪氨酸酶基 因的供体菌为 P．real— 2．2 发 酵培养基 的筛选 tophitia．以pUC18为克隆载体 ．受体 菌为 E． 用正 交试验 法研 究 W Y8产黑 色 素 的发 coliHB101，得到 的工程菌 WY8的重组质粒 酵培养基配方 上携有 酪氨酸 酶基 因 ．重组质粒 的酶切 图谱 正 交试验 1 以 F 发 酵培养 基 为基础 ， 如图 1，图中 SalI酶切 后 的A 片段 与载体 考察添加牛 肉膏 0．5 j、蛋 白臁 0．5 、 pUC l8大小 相 同 一小片 段约 750bp，即为插 米浆 1 或碳 酸钙 0．3 对黑色 素产量 的 人 的外源酪氨酸酶基 因片段 影 响 ．以 【2 的正交 表来 安排 以上 四因子 之 二水 平的试验 ．底 物 L一酪氨 酸 的浓度 为 0．! ．摇瓶装量 为 50ml，于 37C．250r／min 培 养 48h后 ．测 定各摇 瓶 发酵 液 黑 色素 含 量 。结粜表 明 ．培 养基 中添加碳 酸钙 、牛 肉膏 和玉米浆 ，对黑色素产量影 响不大 ，而