新型选择性瘤坏死因子-α转化酶抑制剂的hplc筛选方法的研究.pdfVIP

摘 要 肿瘤坏死因子-α转化酶(TACE 或ADAM17)属于含锌金属蛋白酶家族。目前大量 的实验研究发现，TACE 具有重要的生理和病理作用，其功能涉及到调节免疫系统、 诱发炎症性肠病以及神经性疾病等。TACE 能催化水解人体内的跨膜型肿瘤坏死因子 -α (pro-TNF-α)转化为可溶性的 sTNF-α；诱发炎症性疾病。因此，TACE 成为治疗炎 症性疾病的新靶标。 人工合成的小分子抑制剂通过抑制 TACE 活性，进而控制炎症时人体内过高的 sTNF-α 水平，因此，寻找这些小分子抑制剂变的尤为重要，而建立有效评价酶抑制 剂活性的方法是筛选这些小分子抑制剂的关键。本文就致力于建立评价TACE 抑制剂 的活性的方法。具体研究内容如下： 1. 采用HPLC 法评价TACE 抑制剂活性。依据底物(12 肽) 的结构，合成了一种新 化合物：DL-α-氨基丙酸- Dpa，作为定量分析的内标物。对酶浓度、TACE 酶促反应 时间、流动相等实验条件进行了优化，获得最佳测试条件，建立了使用内标法定量测 定TACE 活性的HPLC 法；其线性范围为10～400 µmol/L ，检出限(LOD)为0.1 µmol/L 。 然后，在最佳实验条件下，用此法测定抑制剂GM6001 抑制TACE 的半数抑制浓度IC50 值。最后，用此新方法测定标准样品，其日内和日间的RSD 都分别小于5 ％和10％； 回收率在85 ％～115％间。 2. HPLC 法评价MMPs 抑制剂活性。为了满足选择性TACE 抑制剂筛选的需要， 还必须要建立评价MMPs 抑制剂的方法。本实验以MMP-9 作为MMPs 家族的代表酶， 选用连有紫外基团的七肽作为底物，优化酶促反应的实验条件，获得最佳测试条件， 建立了使用内标法定量测定MMP-9 活性的HPLC 法；其线性范围为10～360 µmol/L， 检出限(LOD)为0.05 µmol/L 。然后，用此法评价了抑制剂GM6001 对MMP-9 的抑制 作用，其结果与文献报道的结果基本一致。 关键词：TACE 抑制剂 ，HPLC, 内标法，半数抑制浓度，MMP-9 I Abstract Tumor necrosis factor-α converting enzyme (TACE or ADAM17) is a zinc metalloproteinase. At present, a large number of experimental study found TACE has an important role in the physiology and pathology, its functions are involved in the regulation of the immune system, the induction of inflammatory bowel disease and nerve disease. The membrane-bound tumor necrosis factor-α (pro-TNF-α) is cleaved by TACE to release the soluble sTNF-α, inducing inflammatory diseases. Therefore, TACE becomes a new target of treating inflammatory diseases. When human cause inflammatory diseases, an alternative paradigm for affecting TNF-α levels is via the inhibition of TACE by some small molecule TACE inhibitors. Therefore, it is quite important to screen the small molecule TACE inhibitors. Yet, it is the key point that established the method of assaying the acti