谷胱甘肽对铜孵育肉鸡肝线粒体膜电势膜通透性保护作用.pdfVIP

中国畜牧兽医学会家畜内科学分会 中国·南昌 第七属代表大会暨学术研讨会论文集 谷胱甘肽对铜孵育的肉鸡肝线粒体膜电势及膜通透 性的保护作用 苏荣胜l，潘家强，胡锴，万婷，刘好朋，唐兆新 华南农业大学兽医学院，广东广州510642 线粒体是细胞内主要的能量形成场所，也是各种损伤最为敏感的细胞器之一，所以无论在生理上或病 理上都具有十分重要的意义．大量的研究表明，细胞凋亡的最早期阶段在细胞核病理改变出现之前，线粒 体膜电位就已下降，膜电位消失亦是线粒体损伤的一个重要标志。线粒体跨膜电位一旦崩溃，则细胞凋亡 不可逆转11】；线粒体膜内外的各种物质进出线粒体的通道被称之为线粒体膜通透性转变孔 mitochondrial 的发挥与否；铜是细胞色素氧化酶和铜蓝蛋白等的活性元素，在线粒体电子传递和ATP酶功能中起重要作 用【2】，但铜离子过量时，可通过Feton反应产生大量的H202、OH·，降低抗氧化酶活性和诱发脂质过氧化作 用，从而破坏细胞膜的结构和功能13训。作者所在课题组的前期研究也表明，饲喂高铜日粮能改变肉鸡肝细 胞线粒体膜通透性，导致线粒体呼吸功能和复合体活性降低，肝细胞线粒体生成H202速率加快【5】；谷胱甘 肽 GSH 为机体内一种重要的抗氧化剂，有研究表明其在机体内能够保护许多蛋白质和酶等分子中的巯基 不被自由基等有害物质氧化，从而让蛋白质和酶等分子发挥其生理功能。为了探讨铜离子对肉鸡肝细胞线 粒体膜电势和膜通透性的影响以及谷胱甘肽对铜离子孵育的肉鸡肝细胞线粒体是否具有保护作用，本实验 选用浓度梯度为lOlaM、301aM，50pM的Cu2+和20叽MGSH+501aMCu2+在体外对肉鸡肝细胞线粒体分别 进行孵育，旨在了解线粒体膜电势和膜通透佳随铜离子浓度变化的规律以及谷胱甘肽的抗氧化生理作用。 l材料与方法 1．1试验动物30日龄科宝商品代肉鸡30只，体重约为1．5~2．Okg。 1．2试验方法 1．2．1肝脏线粒体的分离参考1独ey踟a等【6】介绍的方法进行。考马斯亮丽法测定肝线粒体蛋 白浓度，孵育液稀释成39．L．1。值得注意的是：线粒体在室温时易失活，因此，以上操作过 程均要求在冰浴中进行。 Cu2喇激组，于刺激20min时进行线粒体膜电势和膜通透性测定。 GSH+501aM 1．2．3线粒体膜电势测定参考曾源等[71介绍的方法进行。应用浓度为10IxM的罗丹明123 Rhl23 作为线粒体膜电势的指示剂，激发波长为490nm，发射波长为540nto。在暗室内加 入Rhl23后15min，应用基因公司的FLx800型荧光酶标仪观察各组的荧光值变化。 基金项目l国家自然科学基金f3s071900 作者简介，苏荣胜 1974- 男。汉族。兽医师，博士研究生 exlu．∞ 通讯作者：詹兆新，F_,-mail：tangzx@,,w,au 489 中国畜牧兽医学会家畜内科学分会 中国·南昌 第七届代表大会暨学术研讨会论文集 波长时间扫描程序，设置扫描时间为1200s，吸光值为0．4～1．5。紫外分光光度计预热30min 25℃恒温孵育20min，以3mL测定介质作为对照，测定孵育后的含30叫L线粒体的测定介质 Cu2+对线粒体膜通透性 的吸光度。测定lOI．tM、30¨M、50pM的Cu2+和200pMGSH+50I_tM 的影响时，步骤同上，只是在25C时，在线粒体混悬液内分别加入Cu2+和GSH，使其终浓度 Cu2+，通过调节测定介质的量保 依次为10uM、30pM、50pM的Cu2+和200pMGSH+50I_tM 证测定液总量的一致 3rnL ，孵育线粒体20min后，分别记录各实验的时间一吸光度曲线。 1．3数据的处理 应用SPSS统计分析软件单因素方差分析程序 ANOVA 分析各组间的差异显著性， 试验数据用平均值蜥准差 x：t：S．D． 表示，P 0．05具有统计学意义。 2．结果 2．1铜对线粒体膜电势的影响及谷胱甘肽的保护作用 荧光强度越大，表示线粒体跨膜电位越高；反之则低。从图1试验所测得的荧光值可以 看出，孵育液的荧光强度随着铜离子浓度的增加而减弱，尤其当Cu2+浓度为301aM和509M 时，与对照组相比荧光强度明显降低 P 0．05 ，表明线粒体膜电势随铜离子浓度的增加 GSH+501．tMCu2+能够明显增强荧光强度， 而显著下降；与Cu2+浓度为50nM时相比，200pM 抑制线粒体膜电势下降 P 0．05 ，表明GSH能够减轻Cu2≮J线粒体的损伤，对线粒体具有 一定的保护作用。 旋 光 o‘，^，．，‘，‘ 强 度 l ∞∞∞∞∞∞∞∞∞∞o 0 10 30 50 GSM Cu扣浓度 p豫 图1不同浓度的Cu2+RGSH+Cu2+对肝细胞线粒体膜电势影响的比较 Cu2斗组相比，差异显著