实验一、蛋白质含量测定2012.pptVIP

生物化学与分子生物学基础实验 生物化学与分子生物学基础实验 实验一 几种蛋白质定量测定方法的比较 生物化学与分子生物学基础实验 1 掌握紫外吸收法、Folin－酚试剂法（Lowry法）和考马斯亮蓝染色法（Bradford法）测定蛋白质含量的原理和方法 2 掌握分光光度计的原理和使用方法 实验目的 生物化学与分子生物学基础实验 ①有多少样品可供分析; ②蛋白质样品浓度大约是多少; ③样品中含有哪些可能影响定量的化学物质； ④所选方法是否简单、可靠； ⑤含量测定的专一性要求是否很高。 选择合适的蛋白质含量测定方法主要基于几点考虑： 生物化学与分子生物学基础实验 常用的方法 物理性质：紫外吸收法 化学性质：Folin－酚试剂法（Lowry法），BCA法（Bicinchoninic acid 法），凯氏定氮法，双缩脲法（Biuret法），胶体金测定法，等等 染色性质：考马斯亮蓝染色法（Bradford法）、银染法 测定绝对含量应用凯氏定氮法（蛋白质的含氮量为16％）。 生物化学与分子生物学基础实验 蛋白质在紫外光区（190nm-360nm）有两个强烈吸收峰：280nm和190nm。 280nm有吸收的电子所需能量较少，因为这些光子存在于芳香环的共轭双键中，色氨酸(Trp)、和酪氨酸(Tyr)有芳香环，可吸收280nm波长的光子，苯丙氨酸（Phe）、组氨酸（His）也有微弱吸收。蛋白质的吸收强度与上述几种氨基酸的含量有关，因此相同浓度的不同种类蛋白质，其280nm的吸收值差别很大(图1)。 紫外吸收法 生物化学与分子生物学基础实验 图1.蛋白质和核酸的紫外吸收光谱 图A是15μg /ml蛋白的吸收光谱。图A中插图是1mg/ml的牛免疫球蛋白IgG(I)、牛血清白蛋白(B)和白明胶(G)的吸收光谱，缓冲液为：0.01% Brij35,0.1M K2SO4,5mM KH2PO4,pH7。 图B是10μg /ml RNA和DNA的吸收光谱。 生物化学与分子生物学基础实验 肽键在190nm有强吸收峰。 一般分光光度计在190nm的光强较弱，且O2在此波长有吸收，因此通常使用205nm或210nm波长，Trp, Phe, Tyr, His, Cys, Met, and Arg的侧链在此波长有吸收。优点：灵敏，较稳定。 缺点: 干扰因素多。许多化学物质特别是含C＝C双键和C＝O双键的物质在此波长范围有吸收，所以必须严格控制反应条件。 紫外吸收法 生物化学与分子生物学基础实验 优点： 不需添加任何试剂，因而对样品没有任何破坏； 测量极其简单迅速； 蛋白浓度和吸光度是线性关系，容易计算。 适合测试纯度较高、成分相对单一的蛋白质。 紫外吸收法 生物化学与分子生物学基础实验 缺点： 干扰测定的影响因素多，尤其是RNA和DNA在此波长均有强吸收, 所以一定要考虑样品中是否有核酸.要得到准确可靠的结果，必须严格控制样品溶液的pH和化学组成，使待测样品和标准样品的实验条件一致。 敏感度低，要求样品的浓度较高，量较大。 用标准曲线法测定蛋白质含量时，对于那些与标准蛋白中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，误差较大。 紫外吸收法 生物化学与分子生物学基础实验 管号 0 1 2 3 4 5 6 7 标准蛋白溶液（ml） 0 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 4.0 0 双蒸水（ml） 4.0 3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0 0 蛋白质含量(mg/ml) 0 0.25 0.375 0.5 0.625 0.75 1.0 ? 未知蛋白溶液（ml） - - - - - - - 4.0 A280 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 操作步骤 紫外吸收法 生物化学与分子生物学基础实验 考马斯亮蓝染色法（Bradford法） 原理：该方法由Bradford于1976年建立。在酸性条件下，考马斯亮蓝与蛋白质结合后最大光吸收波长由465nm（红色）转移为595nm（蓝色），起作用的主要氨基酸是Arg，另外，His, Lys, Tyr, Trp和Phe也有作用。 2－5min呈最大光吸收，至少可稳定1小时 生物化学与分子生物学基础实验 简便, 迅速，灵敏度较高。只需要一种反应试剂 影响因素较少。去污剂和两性物质对测定有干扰 小于3000Da 的多肽无法测定 蛋白浓度高时非线性 配制的染色液需过滤除去未溶解的考马斯亮蓝G250 考马斯亮蓝染色法（Bradford法） 生物化学与分子生物学基础实验 实验操作步骤 室温放置5分钟后测595nm的光吸