RT-PCR检测猪繁殖和呼吸障碍综合征病毒方法的建立和应用.pdfVIP

中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会成立20周年庆典暨第十次学术研讨会论文集 RT—PCR检测猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒方法的建立与应用 庞耀珊，谢芝勋·，何竞铭，廖敏， 邓显文，谢志勤，刘加波，唐小飞 (广西南宁市友爱北路5】号广西兽医研究所，530001) 猪繁殖与呼吸障碍综合征(Porcine and ReproductiveRespiratory 干胎和产弱仔等繁殖障碍以及仔猪的呼吸道症状和高死亡率为特征。该病自1987年首次在美国发现以 来，已迅速传播至世界各地养猪业发达的国家和地区，并导致了严重经济损失。目前我国也有该病流行。 快速检测诊断是有效防制该病的首要前提。 常规诊断方法不仅特异性差，敏感性低，操作繁琐费时，而且很难对PRRS进行快速鉴别诊断，临 床上该病还易与猪瘟、猪细小病毒和布鲁氏杆菌等病原引起的疾病相混淆。为了有效控制该病的发生， 建立一种准确可靠、快速敏感的病原检测方法已显得十分迫切与必要。随着现代分子生物学技术的迅速 检测方法，并用该方法对PRRSV毒株和临床样品进行了检测。现将结果报道如下： 1、材料与方法 本实验室鉴定并保存。 及猪伪狂犬病病毒(PRV)由广西兽医研究所保存。 1．3 临床样品及其预处理：38份临床样品，为广西部分地方猪场送检的流产胎儿组织和有呼吸困难症 状的待检猪的肺、胸颈淋巴结和肾等组织。临床样品的预处理：无菌采取19上述组织病料，约置于乳 min，收集上清 钵或玻璃研磨器中，加入4mL无菌PBS充分研磨，收集组织悬液。以650g离心5 液，供总RNA抽提，或者一20℃保存备用。 I．4引物的设计与合成：参考已发表的PRRSVN基因序列，设计合成了一对引物，其扩增大小为433 bp，引物序列如下： XZl47：5’一ATGGCCAGCCAGTCAATCA一3’ XZl48：5’一TCGCCCTAATTGAATAGGTG一3’ 引物由大连宝生物工程公司合成，使用时用适量超纯水稀释，分装成2mL／管，一20℃保存备用。 1．5 总RNA／DNA抽提：病原总RNA的抽提用TrizolRNA抽提试剂参照谢芝勋方法进行，并按 1．6 RT-PCR反应：RT-PCR试剂盒，购于TaKaRa公司。 1．6．1cDNA合成：采用20u MgCl2，犁L10xPCR缓冲液，舢L2．5mmol／LdNTPs，m L50 5 DEPC pmol加L上游引物XZl47，】“Lunits．加LMulv反转录酶，犁L待检总RNA，牟LH20， 5 瞬时离心。在PCR仪上，以42℃30rain，97℃5min，4Cmin进行cDNA合成。 1．6．2PCR扩增：采用10qL反应体系，在2qLcDNA产物中加入q 中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会成立20周年庆典暨第十次学术研讨会论文集 舢L10xPCR缓冲液，IuL50 5units加LDNA聚合酶，65．5 pmol加L下游引物XZl48，0．早LTaq uLdH20，在PCR仪上进行PCR扩增。首先9422变性5min，然后94℃变性Imin，6022退火1 min，72℃延伸2min，循环35次后，最后72℃延伸10min，于4℃结束反应。 i．6．3 胶样品孔中，以5V／cm电压电泳，凝胶EB染色后置紫外检测仪上观察分析结果。 1．7 扩增，同时以其它猪病病原的核酸模板为对照，检测其特异性。 I．8PRRSV RT—PCR方法的敏感性试验：按Sambrook方法5嘲定PRRSVRNA的纯度和浓度， 并i0倍递进稀释后作为模板加入RT—PCR反应体系中进行扩增，检测其敏感性。 1．9PRRSV