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半合成p内酰胺类抗生素相关工业用酶的研究进展 杨晟杨蕴刘姜卫红 中国科学院上海生命科学研究院植物生理生态研究所 上海市枫林路300号，邮编200032 电话021真021 半合成0内酰胺类抗生素的生产正经历一场变革。现代生物技术正在逐步 进入化学法生产内酰胺抗生素中间体这一传统领域。随着代谢工程技术、重组 酶表达以及固定化酶技术的快速发展，生物法制备B内酰胺类抗生素的技术水 平也在不断提高。我们从”七五”开始进行半合成B内酰胺抗生素相关工业用 酶的研究，在承担国家科研项目的同时，积极开展了与医药企业的合作，研究 内容涉及母核与侧链原料的生物转化以及产品的酶法半合成等方面， 所研究的 酶类处于从基础研究到工业规模应用的不同阶段。 里篮 用我们高产菌株生产的青霉素G酰化酶，经固定化形成的生物催化剂，目 前在国内的市场占有率达70％以上(数据来源于浙江顺风海德尔公司)。应用 固定化青霉素酰化酶分别裂解青霉素G和扩环酸生产6一APA和7-ADCA的工艺 已相当成熟。 目前，国内7-ACA的生产还以化学法为主，双酶法工艺虽已渐趋成熟，但 是裂解头孢菌素C所需的商品化酶制剂CC2价格昂贵，造成酶法工艺的成本居 高不下，研发能替代CC2的廉价酶制剂是当前的重点；我们在“七五”至 “九五”连续三期的攻关研究，用产D氨基酸氧化酶和GL一7ACA酰化酶的细 胞，可成功地对头孢菌素c进行转化，并经历了由实验室试验至中试放大的过 程。但是细胞转化工艺较为繁杂，且存在重复性差的缺点。近年来。我们把研 究重点放在了固定化酶制备工艺上。 D一氨基酸氧化酶工程菌已完成5升规模发酵罐的发酵条件优化建立了高效 C上，得到的 的酶分离纯化技术，所得到的溶液酶纯度极高，固定在Eupergit 固定化DAO作用于3％头孢菌素c钠盐水溶液，产物与GL一7ACA标准品一致， 转化率高于90％。GL-7ACA酰化酶工程菌已完成5升规模发酵罐的发酵条件优化 45 以及酶的分离，纯化和固定化研究，工艺大为简化，载体成本远低于商品载 体，作用于GL一7ACA，产物与7-ACA标准品一致，转化率不低于90％。 Q=氢基酸趔壁 “八五”期间，山西省生物研究所采用产D一海因酶和N一氨甲酰水解酶的 假单胞菌细胞从对羟基苯海因直接合成D一对羟基苯甘氨酸(D—HPG)，并在“九 五”进行中试，目前已有几家企业采用此法成功地实现了规模生产。D-HPG产 品质量和成本都优于化学法。但是，用菌体转化存在生产周期长和批次间不稳 定的现象。固定化酶法是生产D-HPG的根本解决方法。最近我们从一株 Burkholderia pickett／i克隆了D一海因酶基因，并完成了序列分析，酶蛋白表 达，纯化。同时，在成功解出D一海因酶的晶体结构的基础上，对其热稳定性进 行了分析。有关这D一海因酶和N一氨甲酰水解酶的高效表达，大规模纯化，固定 化以及蛋白质工程研究也在进行中。 酶法半合成 半合成B内酰胺抗生素的酶法合成研究起始于20世纪70年代，但由于酶 的性能差，把反应产物和末反应的原料从反应混合物中分离的技术也一直未能 得到很好的解决，因此，多年来酶法合成技术仍处于实验室研究和试生产阶 段。近年来，酶法合成半合成B肉酰胺抗生素技术水平不断提高，不仅在青霉 素G酰化酶的生产和固定化技术方面取得了突破，而且反应底物、酶缩合条件 及产物分离技术的研究方面也取得了重要进展，具备了大规模工业化生产的条 件。 但是酶法合成技术的核心一一青霉素G酰化酶的合成活力和稳定性都有待 改善。目前使用最多的商品化青霉素G酰化酶来自大肠杆菌和巨大芽孢杆菌， 虽然这些酶能稳定高效地催化B内酰胺抗生素的裂解反应，但是却不能满足酶 法合成§内酰胺抗生素的要求。这是因为(1)酶在合成反应介质中的工作稳 定性不够(2)对侧链和产物的水解活力过高，即合成／水解(SlH)低，造成收率 下降。 我们对原先的裂解用青霉素G酰化酶进行了有理设计，得到的合成酶的稳 定性提高了8倍，S／H已经比野生型的青霉索G酰化酶提高了2倍。 结论麴羼望