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激光共聚焦技术与非损伤微测技术结合的优势 点击次数：999 发布日期：2010-2-24 来源：本站 仅供参考，谢绝转载，否则责任自负 2008年诺贝尔化学奖授予三位发现荧光蛋白的科学家，表彰他们对生命科学发展的重要贡献。荧光技术是现代生命科学研究中非常重要的技术，也是目前检测生物体样品内离子分子状态的最佳手段。激光共聚焦技术的出现，使荧光技术如虎添翼。通过共聚焦显微镜和飞秒红外激光器等部件的配合使用，不仅可以得到非常清晰的荧光图像，进行多重荧光标记的定位和定量分析，还具有图像三维重建、荧光共振能量转移谱测定甚至膜电位测定等功能，成为生命科学研究的重要技术手段。近年来，应用激光共聚焦技术发表的高水平研究成果越来越多，受到生命科学家的广泛关注。 但随着激光共聚焦技术应用范围的扩大，其在研究中的局限性也突显出来。激光共聚焦技术可以视为对荧光技术的重大改进，但并未对荧光技术作出本质改变，因而荧光技术的固有缺陷也在激光共聚焦技术上体现出来。首先，激光共聚焦技术主要获得的是生物样品内部的离子分子信息，这些离子分子信息的改变既可能源于样品内部离子分子源的变化，也可能源于样品内外的离子分子交换。这两种离子分子变化过程是由完全不同的生命机制引发的。尽管激光共聚焦技术也可以测量生物样品外部的离子分子信息，但存在许多问题影响测量的准确性。这导致共聚焦数据的重大缺陷，必须通过大量的后续实验才能得出比较准确的结论。若单纯用激光共聚焦数据作为检测或诊断标准，往往面临很大的假阳性风险。其次，激光共聚焦测量时必须向生物样品内导入荧光物质，不仅操作过程复杂，而且这些荧光物质对样品活性有已知或潜在的影响，甚至可能导致样品生理状态改变，造成数据失真。这些问题已经成为激光共聚焦技术发展的瓶颈，严重制约了它的进一步应用。 为克服现有激光共聚焦技术存在的问题，必须使激光共聚焦技术能够同时准确获得被测样品内外的离子分子信息并尽量减轻测试过程中对样品的损伤。现有的激光共聚焦技术体系要实现这两点非常困难，而激光共聚焦技术与非损伤微测技术的结合却可以轻松做到。 非损伤微测技术是一大类选择性/特异性微电极技术的总称。1990年，非损伤微测技术诞生于产生过多为诺贝尔奖获得者的美国MBL实验室（2008年诺贝尔化学奖得主之一下村修曾在该实验室工作多年）。与其他侵入式测量技术最大的区别在于，非损伤微测技术测试过程由电脑自动控制微电极运动，非常接近样品表面而不接触样品进行测量，获得样品外环境的离子分子的绝对浓度、流动速率和流动方向的信息。非损伤性测量是非损伤微测技术的重要特色，测试在与生物样品真实生存环境相似的液体中进行，不导入任何外源物质，最大程度保证了样品的生物活性和生理状态。也正由于测试过程中微电极不需要接触样品，使得非损伤微测技术被测样品范围非常广泛，从动植物整体、器官、组织、细胞聚集体、单个细胞到富集的细胞器均可。而获得离子分子的流动速率和流动方向则是非损伤微测技术的鲜明优势，也是其他技术手段难以获得的重要信息。与浓度反映的离子分子静态信息相比，流动速率和流动方向反映的则是离子分子动态信息，样品外环境的离子分子流动速率和流动方向实质上表征的是样品内外离子分子的交换情况，更能反映生命活动过程的本质。除此之外，非损伤微测技术还具有多电极、长时间、多角度测量等特色。 正因为非损伤微测技术的上述优势和特色，自诞生以来便获得了越来越广泛的应用，迄今已在《Science》、《Nature》等国际著名杂志发表论文百余篇。非损伤微测技术所获取数据和激光共聚焦技术获取的数据有很大互补性，两者结合可以同时准确检测样品内外离子分子的变化情况，提供生命活动过程的完整信息，明确生命活动机制机理。非损伤微测技术可以测量生命活动中常见的五十多种离子和分子，覆盖了激光共聚焦技术的检测范围。而非损伤微测技术在测量时也需要配备显微镜，这使非损伤微测技术和激光共聚焦技术的结合有了硬件基础。 早在2001年，葡萄牙学者在《Nature Cell Biology》发表研究论文，应用非损伤微测技术和激光共聚焦技术同时检测卵细胞与配子融合过程中卵细胞内外Ca2+的变化情况。非损伤微测技术检测发现，在融合一瞬间，胞外Ca2+有一个非常明显的内流，而此时激光共聚焦技术发现胞内Ca2+显著增加，如下图所示。这充分说明卵细胞和配子融合过程中胞内Ca2+的增加源于对胞外Ca2+的吸收而非内源Ca2+释放，解决了长期悬而未决的科学难题。 非损伤微测技术与激光共聚焦技术同时测量细胞内外Ca2+ 上述实例是非损伤微测技术和激光共聚焦技术结合的滥觞。非损伤微测技术和激光共聚焦技术的结合瞄准当今生命科学界以揭示生命活动机理和功能为主要研究内容的潮流，全面反映生命活动的信息，所产出数据有很强的说服力，易于产生高水平研究成果