白术、苍术种子位点特异性PCR鉴别方法研究.pdfVIP

第 38卷第 l6期 中圈中药杂右、 V01．38．Issue 16 2013年8月 Ch}nBdourrl8lotChineseMe~rlaMedica August，2013 白术、苍术种子位点特异性 PCR鉴别方法研究 曹亮 ，蒋超 ，彭华胜。，陈敏 ，袁媛 (1．中国中医科学院 中药资源中心，北京 100700；2．湖南省农业科学院农业生物资源利用研究所， 湖南 长沙410125；3．安徽 中医学院，安徽 合肥 230038) [摘要] 目的：筛选 白术、苍术鉴别 SNP位点，并设计特异性引物，实现白术、苍术种子的快速鉴定。方法 ：通过测序及 GenBank中下载获得 白术、苍术的psbA-trnH序列，通过使用Bioedit软件比对获得SNP位点，设计位点特异性PCR引物 ，将 ITS 通用引物加入到特异性引物构建多重PCR体系，并优化 PCR条件，对 白术、苍术种子进行分子鉴定。结果：构建了多重PCR 鉴别体系，通过一个 PCR反应，能扩增出苍术、白术约643bp的ITSDNA质控条带，扩增出白术 172bp的特异性鉴别条带，实 现白术、苍术鉴别。结论：使用位点特异性PCR技术可以有效鉴别 白术、苍术种子。 [关键词] 白术 ；SNP；分子鉴定；种子 中药材 白术是菊科 Compositae植物Atractylodes 药材种子的分子鉴定，为 白术种子质量标准制定提 macrocephalaKoidz．的干燥根茎，多为栽培品，主要 供参考。 产于浙江、安徽、湖北、湖南、江西等省。种子繁殖是 1 材料 白术传统的生产方法 ，但 目前许多药材种子都是 自 白术种子于 2011年购 自于河北安国药市及 留种或从药材市场购买，种子缺少足够的检测检验 2012年采 自湖南长沙，苍术于2011年采集 自河南、 标准和合格包装…，存在不少陈旧种子、不完全成 湖北、山西、河北、山东等地，材料来源及鉴定人见表 熟种子或伪品l2引，如何科学鉴定中药材种子，建立 1，凭证标本保存于中国中医科学院中药资源中心。 中药材种子标准意义重大 J。 2 方法 白术与其近缘种苍术种子形态上很相似，在实 2．1 DNA提取 际生产和种子销售 中容易混杂。苍术来源植物为茅 将干燥种子研磨成粉 ，取约 0．01g粉末置于 苍术A．1ancea或北苍术A．chinensis，据 2010年版 2．0mL的微量离心管中，加入 900txL已灭菌的 《中国药典》记载，白术和苍术在功效上存在显著差 CTAB提取液 (2％ CTAB，100mmol·L s—HC1， 异 J，因此如何准确鉴别2种药材的种子，保证 白术 20mmol·L～ EDTA，1．4mol·L NaC1)，0．01g 种质来源、避免种源混杂，对保障白术药材质量以及 PVP40000，10IxL口一巯基 乙醇充分振荡混匀，65℃ 安全用药具有重要意义。 水浴 1．0—1．5h，期间轻摇2～3次。水浴结束后取 关于白术与苍术的鉴定研究已有报道 6J，但对 出，冷却至室温，加人 900 酚，氯仿．异戊醇 于其种子的来源鉴别研究鲜有报道。近年来，以分 (25：24：1)，充分振荡混匀，12000×g离心 10min。 子生物学为基础的检测方法被应用于药材鉴别中， 取上清，加入等体积氯仿一异戊醇 (24：1)，充分振