细胞热力学研究方法2.pptVIP

四、显微操作技术micromanipulation technique 第二节 细胞组分的分析方法 一、离心技术 （一）差速离心 Differential centrifugation 特点： 介质密度均一； 速度由低向高，逐级离心。 用途：分离大小相差悬殊的细胞和细胞器。 沉降顺序：核——线粒体——溶酶体与过氧化物酶体——内质网与高基体——核蛋白体。 可将细胞器初步分离，常需进一步通过密度梯离心再行分离纯化。 （二）密度梯度离心 二、 细胞内核酸、蛋白质、酶、糖 与脂类等的显示方法 ? 原理：利用一些显色剂与所检测物质中一些特殊基团特异性结合的特征，通过显色剂在细胞中的定位及颜色的深浅来判断某种物质在细胞中的分布和含量。 显示方法 三、特异蛋白抗原的定位与定性 四、细胞内特异核酸的定位与定性 （二）Southern杂交 是体外分析特异DNA序列的方法，操作时先用限制性内切酶将核DNA或线粒体DNA切成DNA片段，经凝胶电泳分离后，转移到醋酸纤维薄膜上，再用探针杂交，通过放射自显影，即可辨认出与探针互补的特殊核苷序列。 将RNA转移到薄膜上，用探针杂交，则称为Northern杂交。 （三）PCR 技术 五、放射自显影术 用于研究标记化合物在机体、组织和细胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用机理、作用部位等等。 原理：利用同位素的放射自显影，对细胞内生物大分子进行定性、定位与半定量研究；将放射性同位素标记的化合物导入生物体内，经过一段时间后，制取切片，涂上卤化银乳胶，经放射性曝光，使乳胶感光。实现对细胞内生物大分子进行动态和追踪研究。 一般用14C和3H标记。常用3H-TDR来显示DNA，用3H-UDR显示RNA；用3H氨基酸研究蛋白质，用3H甘露糖、3H岩藻糖研究多糖。 14C半衰期为5730年，3H为12.5年。 * * 是在倒置显微镜下利用显微操作器进行细胞或早期胚胎操作的一种方法。 包括细胞核移植、显微注射、嵌合体技术、胚胎移植以及显微切割等。 细胞核移植技术已有几十年的历史，1952 年，Briggs和King等将不同阶段的蛙胚细胞核注入去核的蛙卵，构建核移植胚。Gordon（1962）证明原肠胚以后的细胞核移植能发育到成体。1997年，Wilmut等克隆了绵羊Dolly。 显微操作仪 是分离细胞器及各种大分子基本手段。 转速为10~25kr/min的离心机称为高速离心机。 转速25kr/min，离心力89Kｇ者称为超速离心机。 超速离心机的最高转速可达100000r/min，离心力超过500Kg。 差速离心 Low speed High speed Differential centrifugation Velocity (A) and Equilibrium (B) sedimentation 用介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过离心力场的作用使细胞和细胞成分分层、分离。 类型：速度沉降、等密度沉降。 常用介质：氯化铯、蔗糖、多聚蔗糖。 分离活细胞的介质要求： 1）能产生密度梯度，且密度高时，粘度不高； 2）PH中性或易调为中性； 3）浓度大时渗透压不大； 4）对细胞无毒。 金属沉淀法：如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反应产物最终生成CoS或PbS有色沉淀，而显示出酶活性。 Schiff反应：醛基可使Schiff试剂中的无色品红变为红色。用于显示糖和脱氧核糖核酸（Feulgen反应）。 联苯胺反应：过氧化酶分解H202，产生新生氧，后者再将无色联苯胺氧化成联苯胺蓝，进而变成棕色化合物。 脂溶染色法：借苏丹染料溶于脂类而使脂类显色。 茚三酮反应：显示蛋白质。 Schiff反应 联苯胺反应 免疫细胞化学 immunocytochemistry 是利用抗体同特定抗原专一结合的原理，对抗原进行定位测定的技术。常用的标记物有荧光素和酶。 （一）免疫荧光法（immunofluorescent technique）：快速、灵敏、有特异性，但其分辨率有限 如异硫氰酸荧光素、罗丹明等。 （二） 蛋白电泳(SDS) 与免疫印迹反应(Western-Blot) 免疫印迹(Immunoblotting)或蛋白质印迹(Western blotting)是检测目标蛋白质的一项十分有效的方法。 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS） 十二烷基磺酸钠(SDS)和少量巯基乙醇 蛋白质中的多肽链处于伸展状态 形成SDS-蛋白质复合体 具有相同的荷质比 具有相同的构象 蛋白质 电泳速度由质量决定 原理 十二烷基磺酸钠 原态蛋白质 磺酸基 极性亲水 烷基 亲油（蛋白质疏水区） 蛋白质样品 电泳 荧光素酶或放射性同位素标记的第二抗体起反