纳米金胶标记DNA电化学探针的制备及金标银染法在DNA杂交检测的应用.pdfVIP

． !!堂丝皇坌堑些兰——————————————————一 。 纳米金胶标记DM电化学探针的制鱼及金标银染法 在DNA杂交检测的应用 蔡宏何品刚方禹之 (华东师范大学化学系，上海200062) 关t词：金胶．电化学探针，DNA杂交，金标银染髓 电化学DNA生物传感器是对特定DNA序列及DNA链中碱基突变进行分析和检测的重 要手段，具有巨大的发展前景“3。金胶是一种应用广泛的抗原、抗体和细胞标记物…。本 文用纳米金胶标记寡聚核苷酸，制成具有高灵敏度、高选择性的金胶DNA电化学探针，使 其选择性地与固定于电极表面的寡聚核苷酸进行杂交作用，再辅助以‘金标银染技术’，实 现对特定序列的DNA片段以及基因的碱基突变的识别和电化学检测，检测限达到 50pmoLL一。 金胶标记DN^电化学探针的制备将30D巯基修饰寡聚核苷酸溶解在8ml新制备的 冲溶液将探针稀释成一定的浓度，4C低温保存，用于下一步的杂交检测。 杂交反应与银染分别将已固定了相同量的待测寡聚核苷酸片段(完全互补单链DNA， xSSC缓冲溶液中 三碱基突变及非互补的单链DNA)的玻碳电极”。与金胶标记DNA探针在2 进行杂交反应，42℃恒温均匀搅拌 1h．取出后用SDS清洗液清洗三次再 用二次水清洗三次，将杂交后的玻碳 电极放入4ml银染液中，在室温条件 下均匀搅拌，反应10min，然后用二 次蒸馏水清洗3次每次3min，除去未 反应吸附的银染液。 电化学测定 采用三电极系统， —j：c￡宝u 铂丝为对电极，饱和甘汞电极为参比 电极，杂交和银染后的玻碳电极为工 作电极，0．1moLL1的醋酸缓冲溶液 (pHS．2)为底液，记录DPV曲线。 金胶DNA电化学探针对不同 Potontia!，mVvs．SCE DNA片段的识别和检测我们把与 图1不同序列DNA与金胶标记DNA探针杂交后的DPV响 探针序列完全互补的、存在单个碱基 错配的及完全非互补的寡聚核苷酸片 应A．完全互补DNAB．单碱基突变DNAc．非互补 段分别固定在玻碳电极表面；然后与金胶标记寡聚核苷酸探针充分杂交；银染反应后取出 扫描银的差分脉冲伏安(DPV)线(如图1)，结果表明：完全互补配对的寡聚核苷酸(曲线 柚与金胶DNA探针杂交后的DPV图，在+0．38V时得到一较强的氧化峰对应于金胶外围 银原子的氧化，其峰电流是存在一个碱基错配的寡聚核苷酸片段(曲线B)与探针杂交后DPV 信号的两倍。而非互补链与探针杂交后几乎没有DPV信号(曲线c)。表明金胶DNA电化学 15 苎!!旦全里皇坌堑些堂堂查叁坚丝塞叁 一． 探针对与之完全配对的DNA和存在碱基错配的DNA片段有较强的序列选择性。 DNA杂交及检测条件的优化选择NaCI浓度为0．3m01．L-‘。杂交缓冲液pH值在5-8 范围内无影响，而随杂交时间在O一60min范围内DPV信号呈增强的趋势。实验中选择在 含0．3m01．L。1 染时间呈线性关系，当时间再增大时银染中Ar在DNA链上的非特意性吸附随之发生，造 成干扰，实验中选择8min的杂交时间并加入硫代硫酸钠使Ag+转化成Ag(S203)3’以减少干 扰。 金标银染电化学DNA传感器的检测限将一系列浓度的互补寡聚核苷酸溶液分别固 定在玻碳电极上，与金胶DNA探针溶液进行杂交反应。经银染反应后进行电化学检测。在 一定范围内，电极上寡聚核苷酸的量与杂交后DPV信号成线形关系。在线性范围1．0 尔浓度；Y为DPV峰电流，单位：们)，相关系数为0．9976。该体系对特定序列DNA的最低 检测下限为5．0×10。11m01．L4(3a，o为空白溶液相对标准偏差。n=11)。 参考文献 1 Paleeek E．．Fojta，M．，Anal．Chem．，2001，73：74A·83 2 Link Z