鸡传染性法氏囊病病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立.pdfVIP

中国畜牧兽医学 畜牧兽医生物技术学分会暨中国免疫学 兽医免疫分 第七次研讨 会论文集 鸡传染性法氏囊病病毒实时荧光 定量RT-PCR 检测方法的建立 王永强，祁小乐，高宏雷，高玉龙，宇文延青，林欢，秦立廷，宋修庆， 笑梅* ( 中国农业科学院 哈尔滨兽医研究所 兽医生物技术国家重点实验室，黑龙江 哈尔滨 15000 1) 摘 要：根据GenBank 中鸡传染性法氏囊病病毒基因组设计了一对针对病毒 5 基因的引物和一条特异的 Man 水解探针，建立了一种 感、特异、重复性好的快速检 鸡传染性法氏囊病病毒核酸载量的 Man ，使得该方法在 6 1 荧光定量RT-PCR 方法。通过对反应条件和反应体系的优化 10 10 拷贝/滋L 范围内具有良好 的线性关系，可 感地检 初始模板中30 个拷贝的病毒核酸，其灵 度是常规 RT-PCR 检 方法的 100 倍。 该方法不与其它的禽源病毒发生非特异性反应，并且具有良好的重复性。该方法为鸡传染性法氏囊病病毒的定 性定量检 提供了有力的工具。 关键词：鸡传染性法氏囊病毒；荧光定量RT-PCR ； Man 水解探针 鸡传染性法氏囊病(Infectious Bursal Disease ， 性、特异性和时效性等方面存在着不足，在病毒的 IBD) 是由鸡传染性法氏囊病病毒(Infectious bursal [4] 早期诊断中体现得尤为明显 。随着分子生物学技 disease virus ，IBDV) 引起的危害雏鸡的一种急性、 术的发展和对IBDV 研究的深入,新的诊断方法不断 。 高度接触性、病毒性传染病 IBD 不仅能引起雏鸡 涌现，尤其是荧光定量 PCR (Fluorescent quantitative 死亡，而且能导致雏鸡免疫抑制，并发或继发其他 PCR ，FQ-PCR) 技术以其快速、灵 、特异性强等 疾病，降低机体对疫苗的反应强度。因此，自从该 优点在基因表达水平的分析、病原体的定性和定量 [5 ，6] 。 病发现以来，一直是养禽业关注的重要疾病 IBDV 检测等方面得到了广泛的应用 。本研究将荧光定 属双 RNA 病毒科 (Birnaviridae) 双 RNA 病毒 属 量PCR 技术用于IBDV 的定量检测,通过特异性、 [ 1] (Birnavirus) 。其基因组由A 、B 两个节段组成 。B 感性、重复性验证,建立了IBDV 荧光定量RT-PCR 节段长约2 827 bp ，只有一个 ORF ，编码VPl 蛋白 检测方法,为今后IBDV 的快速诊断、病原学和免疫 (90 ku) 。A 节段长约3260bp ，包括大小两个部分重 抑制机理研究提供了有力的工具。 叠的开放阅读框(Open reading frame ，ORF) 。小ORF 编码 VP5 蛋白( 17