DNA电致化学发光探针及其在DNA序列分析中的应用.pdfVIP

第八届全国电分析化学学术会议论文集 DNA电致化学发光探针及其在DNA序列分析中的应用 杨敏丽刘传之黄亮何品刚方禹之 (华东师范大学化学系，}：海200062) 关键词： 电致化学发光，DNA．氨丁基已基异鲁米诺(A眄I) DNA是生命体内的重要遗传物质。研究发现，人类的很多遗传疾病都与DNA分子中碱 基序列的突变有关。因此要实现分子水，F上人类遗传疾病的基因诊断，快速而准确地测定 DNA序列将是其中的一个关键因素。 。DNA杂交分析是DNA序列分析中最常用的分析方法。即根据DNA序列互补的专一性特 点，使目标DNA与己知序列的DNA探针在一定条件下进行杂交反应，测定杂交反应后某些 信号的变化来确定目标DNA的序列及含量。传统的标记法虽然灵敏度高，但操作烦琐，且 使用放射性同位素，因此已逐渐被非放射性标记法，如荧光法，化学发光法和电化学法等 代替。 电致化学发光法是由电化学法和化学发光法结合起来的一种分析方法，它具有二者 共同的优点，不仅灵敏度高，而且选择性好，分析速度快，操作简单方便。国内目前结合 标记技术，将电致化学发光法应用于DNA测定的研究还未见报道。ABEI是一种环肼类物 质，它在碱性溶液并有过氧化氢存在的条件下可以产生很强的电致化学发光。本文作者通 过偶联活化剂EDAC将ABEl成功地标记在合成的单链DNA分子上，制备成了DNA电致化学 发光探针。再将目标DNA固定在聚吡咯修饰的Pt电极上，此电极与DNA探针在一定条件 下进行杂交反应，通过测定杂交后电极上的电致化学发光信号来确定目标DNA的序列及含 量。 1仪器与试剂 自制电致化学发光分析仪，包括超低频信号发生器(宁波无线电厂)，～lodel173恒电 位仪(美国EG＆G公司)，RS990l发光分析仪(上海容圣生物电子有限公司，台式自动平 衡记录仪(上海大华仪表厂)：三电极系统：工作电极为铂片(5ram×10mm)电极，辅助电极 上海生工生物工程有限公司提供。其他试剂为分析纯，水为二次水。 2实验部分 ABEl电致化学发光条件的选择： ABEI在碱性条件下具有很好的电致化学发光特 性，发光信号的大小受电化学参数和化学反应条件的影响，仔细考察了这些影响因素，确 v(vs 定了反应的最佳条件。脉冲波形：方波脉冲；脉冲幅度：+1．0 Ag／AgCl)；脉冲宽 度：40 10．0)；Hz02浓度：1．2×101mol／L。 ms；反应介质：Na2C03一NaHC03(pH 0．1 ABEI标记DNA电致化学发光探针的制备：将30D末端含磷酸基的ssDNA加入lml 6．O)，充分 上。往反应液中逐滴加入3倍量体积的20：1的无水乙醇和醋酸缓冲溶液(pH 摇匀后放入冰箱冷冻4h以上。取出后离心，得到少量沉淀，即为ABEl标记的DNA电致化 学发光探针。沉淀用70％冷乙醇洗涤数次，除去没有和DNA作用的ABEI。最后用磷酸缓 冲液溶解，放入冰箱备用。 05 ssDNA在电极上的固定：将处理好的Pt电极浸入0 mol／L吡咯的KCl溶液中 (pH 2．o)，在0。+o．7 V电压范围内以50 mv／s的扫速循环扫描12圈，将吡咯以电聚 合物的方式固定在Pt电极表面，形成一个导电的高分子聚阳离子膜。此电极经冲洗后浸 !!堂丝皇坌塑些堂 ’ 一—— ————————-__———————H_——————_—^———————_-●————