基因重组技术1.docVIP

基因重组技术 工具酶 Cohen and his colleagues completed the first gene recombinant experiment in 1973. Hybrid DNA obtained by gene recombination and transformation in vitro was transformed into E.coli in vitro. Necessary material：endonuclease Ligase Vector host cells Gene cloning （molecular cloning）----通过体外重组技术,将一段目的DNA经切割、连接插入适当载体，并导入受体细胞，扩增形成大量子代分子的过程。基因克隆的核心-----体外重组(Recombination) : 人工将一段目的DNA插入一个载体的过程。 限制酶的特点 （a）识别顺序和酶切位点 识别４-8个相连的核苷酸； 呈回文结构； 对称性； 切点大多数在识别顺序之内，也有例外。 限制酶切后产生两个末端，５’-Ｐ和３’-ＯＨ 相容性末端: 可连接在一起。如：BamHI（ＧＧＡＴＣＣ）与MboI（ＮＧＡＴＣＮ）酶切产生的末端，相连后MboI仍可识别，但BamHI的识别只有十六分之一的可能性。 又如: BamHI和BglII(AGATCT)两种酶产生的相容性末端，相连后不能为两种酶所识别和酶切。 （b）末端种类 Three kind terminals after digested by endonucleases a) 5’projected stick terminal （突出的粘性末端） For example, EcoR I 5’-GAATTC-3’ 3’-CTTAAG-5’ b) 3’ projected stick terminal（突出的粘性末端） For example, Pst I 5’-CTGCAG-3’ 3’-GACGTC-5’ c) Blunted terminal (平末端) For example, Sma I 5’-CCCGGG-3’ 3’-GGGCCC-5 异源同序酶 (isoschizomer，同裂酶 ) 定义：能识别相同顺序但来源不同的两种限制性内切酶。 特点：1）识别相同顺序 2）切割位点的异同，如Asp718--KpnI； SacI—SstI (6) 限制酶的星号反应活性（star activity） (a)特点: 限制酶识别序列特异性降低 (b)发生星反应的限制酶和条件 (c)星反应的利用和避免 同裂酶（Isoschizomers ):是指来源不同的核酸内切酶，识别序列相同，切割位点可以相同也可以不同，这类酶称～。 同尾酶 ( Isocaudamers ) :是指识别核酸序列不同，但有相关序列，切割的粘端序列相同 远距离裂解酶 (Distant cleavage) :识别位点与切割位点不一致，但其切割位点与识别位点的距离是一定的，一般为10个碱基左右。 如：Mbo II 的识别序列为5‘-GAAGA-3’切割位点在识别位点下游第8个核苷酸。 可变酶：识别序列中有几个核苷酸是可变的，识别序列通常大于6个碱基对。 λ-Terminase是识别λ-噬菌体DNA的cos序列 (100 bp)，并形成附带12 base的5-末端的用以切断双链DNA的酶,出现的频率约412 。本酶能够有效地切断cos序列。因此，不仅能够用于Cosmid mapping，还能作为cos序列特异性的限制酶使用。 Omega核酸酶（I-SceI）：由内含子编码，用于rRNA的剪切，出现的频率约418 = 6.9 X 1010 bp 限制性内切酶的用途 a.DNA重组 b.限制酶（物理）图谱绘制 c. 突变分析（RFLP分析） d. 限制酶的部分酶切与完全酶切 2. DNA甲基化酶 Methylase (1) 甲基化酶的种类与识别顺序 a. 限制修饰系统I、II、III型中的甲基化酶 三个系统中的甲基化酶可使细菌DNA分子中的胞嘧啶和腺嘌呤发生甲基化，形成5’-甲基胞嘧啶和6’-甲基腺嘌呤： 在DNA重组实验中，常用的甲基化酶属于II型，它与相应的限制酶的识别顺序相同，其甲基化位点与限制酶作用位