偶联亲水层的牛血清白蛋白手性固定相的制备.pdfVIP

第34卷 分析化学 (FENXIHUAXUE) 研究简报 第3期 2006年3月 ChineseJournalofAnalyticalChemistry 385、388 偶联亲水层的牛血清白蛋白手性固定相的制备 李 爽 张凤宝’ 张国亮 (天津大学化工学院，天津300072) 摘 要 在保证完全拆分的前提下，为了减少拆分所需的时间和流动相，对常用的拨基二咪哇活化制备蛋白 质手性固定相的方法进行改进。在偶联牛血清白蛋白之前先偶联一层亲水层，降低溶质与固定相的疏水作用 从而减小了被拆分对映体的保留时间(保留时间由原来的39min减小至8.74min)。分别考察了各种流动相 条件和进样条件对色氮酸对映体保留因子和分离因子的影响。 关扭词 手性固定相，簇基二咪哇，壳聚糖，牛血清白蛋白 1 引 言 手性拆分一直是分析化学领域最具有挑战性的课题之一。液相色谱是手性分离的最为重要的工具 之一，因为液相色谱的适应性要高于气相色谱，制备能力又高于毛细管电泳，而且已有大量的有关手性 分离的报道’一〔’I。在众多的手性柱中，蛋白质是一类颇具特色的手性固定相。蛋白和糖蛋白含有氨基 酸和糖，它们都是手性化合物，具有很好的识别手性化合物的功能，因而受到人们的关注。迄今已经开 发出来的有白蛋白(albumins)如牛血清白蛋白(bovineserumalbumin,BSA)(6I，人血清白蛋白(human serumalbumin,HSA)E7J。糖蛋白’〔〕、卵类糖蛋白[[9I、抗生物素蛋白、核黄素结合蛋白以及各种酶蛋白， 如胰蛋白酶(trypsin)、胃蛋白酶(pepsin)和a-胰凝乳蛋白酶(a-chymotrypsin)[0I等，其中牛血清白蛋 白固定相(BSA-CSP)最为常用。目前合成BSA-CSP的方法一般是先将空白硅胶基质硅烷化(大多是制 成氨丙基硅胶)，然后利用拨基二咪哇[12,131等双官能团物质活化此硅胶，最后再与BSA偶联而成。合成 的BSA-CSP具有很好的手性拆分效果，但L一对映体，例如L一色氨酸，其保留时间很长(大于30min)。这 必然需要投人大量的时间、人力和经费才能进行研究工作，经济上不够合理。本研究对制备方法进行改 进，在用拨基二咪哇活化之前先偶联一层壳聚糖亲水层，有效减小了色氨酸与BSA-CSP的疏水作用。 在保证对映体完全拆分的前提下，大大地缩短了L一对映体的保留时间，节省了大量的时间和流动相，真 正做到经济、快速、有效地拆分对映体。本研究还考察了各种流动相和进样条件对D,L一色氨酸保留因 子k和分离因子。的影响。 2 实验部分 2.1试剂及色谱仪器 色谱系统由泵(HITACHIL-2100/2130PUMP)和紫外检测器(HITACHIL-2400UVDETECTOR)组 成，并配有20WL的进样阀、N2000数据处理工作站(浙江大学智达信息工程有限公司研制)。 拨基二咪哇,3-氨丙基三乙氧基硅烷、D,L一色氨酸(Sigma公司)和二氧六环(色谱纯，天津大学科威 公司);牛血清白蛋白(BSA，天津市生物技术有限公司联星);水溶性壳聚糖(Chitosan，天津市南开精复 化学试剂公司);磷酸二氢钾、磷酸氢二钠(天津市百世化工公司化学试剂厂);叠氮钠(上海化学试剂采 购供应站);硅胶(5lim，天津化学试剂二厂);二次蒸馏水(使用前用0.45p,m微孔膜过滤)。 2.2 牛血清白蛋白手性固定相(BSA-CSP)的制备 2.2.1含有亲水层的BSA-CSP的制备(柱I)制备过程如图1所示。(1)A丙基硅胶的合成 称取 5g硅胶，加人150mL20%的HCI溶液，于110℃下加热回流6h。用二次蒸馏水洗涤至中性，放人真空 干燥箱，在120℃下干燥过夜。将干燥的硅胶加人到80mL用钠丝干燥过的甲苯溶液中，在氮气保护下 2005-03-30收稿;2005-10-15接受 分析化学 第34卷 NH,(CHZ)sSi(OCHZCH3), }Si- OH =Si一一CHZCHZCHZNHZ