大鼠抗小鼠重组膜联蛋白A2单克隆抗体的制备与鉴定.pdfVIP

苏州大学学报 医学版 ;大鼠抗小鼠重组膜联蛋白 单克隆抗体的制备与鉴定 江 淼,沈 飞,包红雨,张丽意,谢丽倩,赵益明,阮长耿 苏州大学附属第一医院江苏省血液研究所卫生部血栓与止血重点实验室,江苏苏州 摘要:目的 建立能够分泌特异性抗小鼠膜联蛋白 的大鼠一小鼠融合单克隆抗体杂交瘤细胞系。 方法 利用重组小鼠蛋白作为抗原免疫 大鼠,通过细胞融合和杂交瘤筛选技术建立特异分泌抗小鼠 蛋白的大鼠一小鼠融合单抗杂交瘤细胞株。采用酶联免疫吸附方法确定单克隆抗体亚型,免疫印迹和流式 细胞术验证所筛选的单克隆抗体的特异性。结果 通过对 多个分泌抗体的融合细胞克隆的筛选,获得一株分泌 特异性抗小鼠 的大鼠一小鼠融合单克隆抗体杂交瘤细胞系 . ,连续培养传代后染色体分析证实, 大鼠脾细胞与小鼠 / 细胞稳定融合;免疫印迹和流式细胞术显示该单克隆抗体可以特异识别小鼠 重组 蛋白。结论 该研究所获得的大鼠一小鼠融合单克隆抗体特异性针对小鼠 蛋白,可用于转基因小鼠 中表达的检测,为深入研究的功能提供了物质保障。 关键词:单克隆抗体;杂交瘤细胞系;膜联蛋白 中图分类号:? 文献标识码: 文章编号: ? ? ? Ⅱ , , ? ,,?,?, ? , , ,,, : Ⅱ . ,? . ? . .? . , , . , .? . 一 Ⅱ . :; ; 膜联蛋白 ,是钙介导的 巨噬细胞、神经细胞和某些肿瘤细胞?。该蛋白的 磷脂结合蛋白超家族成员,表达于内皮细胞、单核 胞外区片段目前认为是纤维蛋白酶原和组织型纤 基金项目:美国血液学会发展中国家研究培训基金资助项目收稿日期:? 一 作者简介:江 淼 一 ,男,江苏常州人,讲师,医学博士,主要从事血栓与止血的基础研究 。; 维蛋白酶原激活物 的共受体,能在血管内皮 大鼠 只,每只小鼠每次腹腔和皮下共注射 上显著增加 介导的纤溶酶形成效率 。有报 纯化的 单体重组蛋白 ,间隔,共 道表明,异常高表达可引起纤溶亢进导致出 免疫 次。第 、 次分别用福氏完全佐剂和不完全 血 。此外, 还与血管新生、肿瘤转移、抗磷 佐剂乳化蛋白后行腹腔和皮下多点注射免疫,末次 用未经乳化的蛋白溶液直接经尾静脉注射加强免 脂综合征、动脉粥样硬化有关 。然而,就整体而 疫,末次免疫后第 取出大鼠脾脏制成单细胞悬 言,在正常人体内的功能及在一些具体疾病 液立即融合或在液氮中冻存。 中所发挥的作用目前仍不完全清楚。在小鼠模型 . . 细胞融合及选择性培养 新鲜制备的大鼠 上研究该蛋白功能时,由于种属特异性和免疫原性 的限制而不能使用源自小鼠的单克隆抗体,可替代 脾细胞与/ 骨髓瘤细胞以 : 的比例混合,与 的选择一是使用多克隆抗体,二是使用特殊处理后 用 培养液配制的 %聚乙二醇 ,分 如生物素化 的鼠源性单抗。但上述方法仍有一 子量溶液作用 ,离心弃去全部,然后将细胞悬浮于选择性培养液中,滴 些应用限制和缺点,比如效价低、非特异背景高等。 针对这个问题,国外有研究者尝试用大鼠的抗体产 加已预先加人 × /孔小鼠滋养细胞的 孔板 生细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合取得了成功。这种 中,置于、 %培养箱中培养,于融合后第 异种间的细胞融合单克隆抗体多因染色体丢失而 、 天更换半量上述选择性培养液, ~ 后 成功率较低,且不能用传统的腹水法生产抗体。一 杂交瘤细胞克隆出现,逐步换成 培养液,再过两 旦研制成功,则是一个很有用的研究工具,而且高 周改用含 %胎牛血清的 完全培养液。 效价的抗体还具有进一步开发成抗肿瘤药物的潜 . . 杂交瘤细胞的筛选和单克隆化 采用酶联 力。本研究尝试用表达的重组小鼠 蛋白免 免疫吸附试验,重组小鼠 单体蛋白 疫大鼠,并将大鼠抗体分泌细胞与小鼠骨髓 用 . / 的碳酸盐缓冲液 . 稀释成瘤细胞融合,以期得到能够有效与小鼠 结合 / ,/,孔加入 孔聚氯乙烯 板中, 的并具有一定功能的大鼠一小鼠融合单克隆抗体。 置 ℃下湿盒内过夜。次 用含 . % ?洗涤后,加人 %//孔,置 ℃下湿盒内过 材料和方法 夜。同上洗涤后,加入细胞培养上清,阴性 . 质粒、菌种、细胞和实验动物 对照加入无关细胞上清, ℃下湿盒内温育 ,洗 含有小鼠 全长 质粒. 涤 次,加入?? :, ℃下湿 由美国康奈尔大学 试验室惠赠,大肠 盒内温育后,显色,酶标仪测 处吸 杆菌、由本室保存。小鼠骨 光度 。 读数。经过上述筛选,最终得到稳定分 髓瘤细胞株 / . 为本室保存。大鼠 泌抗体的阳性细胞株。以有限稀释法将阳性细 ~ 周龄,雌性 购自中国科学院上海实验动物 胞株单克隆化。在 孔板中培养 后, 中心。 法检测克隆阳性率,经过二轮单克隆,阳性