各种层析分离方法.ppt

第九章 各种层析分离方法 教学目的 掌握凝胶过滤及离子交换层析的原理、特点； 掌握亲和层析与其它亲和分离方法的比较； 了解层析分离介质的种类 ? 重点和难点 制备色谱分离技术的应用 ? 课堂教学设计 课堂讲授、实例分析与学生自学相结合 参考书目 1 刘国诠，生物工程下游技术，化学工业出版社 2 严希康，生化分离工程，高等教育出版社 3 孙彦，生物分离工程，化学工业出版社 ? 教学时数 6学时 主要内容 概述 凝胶过滤 凝胶过滤介质 离子交换层析 离子交换层析介质 亲和纯化 最大特点: 核心部分（层析分离单元）可以就地清洗，保证系统在无菌条件下工作，清洗方便。 可进行公斤级生产。 它有Bioprocess I和 Bioprocess II两种型号，其流速分别为4－20 l/h 和40－400 l/h，用于中试及大规模生产。 1介质为不带电的惰性物质，不与溶质分子作用 为了满足近年生物技术以制备为目的的需要，出现许多Bioprocess凝胶。既有凝胶过滤介质也有离子交换介质，此类凝胶的主要特点: 1适用于实验室及大规模的工业生产，在使用中有较高的重现性。 2便于清洗、消毒及再生，介质的使用寿命较长，有优良的化学物理稳定性 3易于装柱，有较高的动态干燥容量，流速较快，有利于工业生产。 （1）凝胶介质为惰性物质 （2）介质内所含的带电基团应尽量少。 （3) 介质内孔径应分布均匀。 （4）介质粒径的均一性好。 (5) 介质要有优良的物理化学稳定性较高的机械强度 1)多糖类骨架介质：亲水性 纤维素凝胶 葡聚糖凝胶（sephadex） 琼脂糖凝胶（sepharose） 2)合成大分子骨架介质（为了克服微生物的侵蚀） 聚丙烯酰胺凝胶（Bio-gel P） 琼脂糖和葡聚糖组成的复合凝胶（Superdex） 强性离子交换剂应用pH范围较广， 弱性离子交换剂的使用pH范围较窄。 动力学容量，变量，表明有效容量时应附有实验条件。 在柱中操作时与流速有关。 需要有机溶剂(乙醇、丙酮等)处理除去生产过程中所用有机溶剂。 3 流速－影响分离效果的一个重要因素 有多种蛋白质被吸附，如果采用一个恒定的洗脱条件，往往不能将所有的组分适当分开，需要改变洗脱条件 5 消毒及树脂的复苏 某些纯度要求较高的产品制备过程中，要求对分离介质进行消毒处理，以防微生物等杂质混入产品中 中毒原因： 1大分子的多点带电，与介质之间进行多点结合，难以进行洗脱，使有效功能基减少。 2一些分子较大在孔道内被卡牢，难以扩散出来，堵塞孔道，在以后的交换过程中影响孔内功能基工作。 3 工作液中的胶状物质被黏附在介质珠体表面，覆盖了功能基。 利用PEG-色素/Aquaphase-PPT(一种淀粉的羟丙基衍生物的商品名)系统从猪肌组织中连续萃取LDH的流程。 随着水相盐浓度的增大，不管亲和助表面活性剂添加与否，反胶团相的对蛋白质的空间排阻作用增大的结果。 脒基为胰蛋白酶的亲和配基，苯甲酸基为pH敏感基团，影响聚合物的溶解度。 聚合物在水溶液中 pH6的溶解， pH5时即可发生完全的沉淀。 亲和沉淀的优点： 1 配基与目标分子的亲和结合作用在自由溶液中进行，无扩散传质阻力，亲和结合速度快； 2 亲和配基裸露在溶液之中，可更有效的结合目标分子。即亲和沉淀的配基利用高； 3 利用成熟的离心或过滤技术回收沉淀，易于规模放大。 4 亲和沉淀法可用于高粘度或含微粒(如，不能在低离心力下沉降的细胞碎片)的料液中目标产物的纯化，因此可在分离操作的较初期采用，有利于减少分离操作步骤，降低成本。同时，在分离过程的早期阶段除去对目标产物有害的杂质（如蛋白酶），有利于提高目标产品质量和收率。 8.5.5亲和过滤法 膜分离 是固定床亲和层析的变型。 亲和层析柱一般采用径向放大的方式，以保证在不增大压力的前提下提高层析柱的处理量。 短粗型亲和层析有利于提高分离操作速度。 1) 亲和膜分离的过程 分离膜改性 亲和膜制备 亲和络和 洗脱 亲和膜再生 分离膜改性： 亲和络和： 2)关键问题 膜上有足够可利用的化学基团 足够表面积和足够大的孔径 孔分布窄、均匀 耐一定机械强度 耐酸碱、高浓度有机溶剂和缓冲液。 3)基质材料 选择关键是能对生物活性物质如蛋白质、酶等进行有效固载化. 基质膜材料选择是膜亲和层析的关键。 5)亲和膜的分离操作方式 ① 亲和超滤过程（采用交叉流动方式） 优点：膜具双重分离功能： 分离目标生物大分子， 去除部分溶剂，达到浓缩目的. 6)亲和膜分离技术应用 从大肠杆菌培养液中纯化苹果酸脱氢酶，用于产品的精制纯化. ①起始膜材料的选择 选用0.65