含双链干涉几丁质合成酶基因的AcMNPV构建.docVIP

 n 含双链干涉几丁质合成酶基因的 AcMNPV 构建# 梁月荣，林晨，邵文韵，郑新强，陆建良** 5 10 15 20 25 30 35 40 （浙江大学茶叶研究所，杭州 　310058） 摘要：几丁质合成酶（CHS）对害虫的生长发育有重要作用，是理想的杀虫剂作用靶标之一。 本文通过茶尺蠖 CHS 基因保守序列克隆、双链干涉中间载体和转移载体构建，成功地将可 转录成发夹结构 mRNA 的外源几丁质合成酶基因插入野生 AcMNPV。为几丁质合成酶基因 功能研究和新型病毒杀虫剂的研制奠定了基础。 关键词：茶学；几丁质合成酶；AcMNPV 病毒；载体 中图分类号：S6 Construction of AcMNPV recombined with doubled-strands chitin synthase gene Liang Yuerong, Lin Chen, Shao Wenyun, Zheng Xinqiang, Lu Jianliang (Zhejiang University Tea Research Institute, Hangzhou 310058) Abstract: Chitin synthase (CHS) plays a key role in pests growth and development. The CHS gene and its translation product were desired targets for pesticides designing. In this study, a conserved fragment of CHS gene, isolated from Ectropis obliqua, and inserted sensely and antisensely into pFGC5941 for CHS dsRNAi vector construction. The CHS dsRNAi gene was then transferred into the pFastBac I for pFGC5941. Recombined AcMNPV was obtained by transformating pFastBac I vector which containing CHS dsRNAi gene into the MAX Efficiency? DH10Bac competent cells which containing wild AcMNPV. This work would be help to illustrate the CHS gene function and develop the nevol virus pesticides. Key words: Tea science; chitin synthase; AcMNPV virus; vector. 0 引言 几丁质作为一种刚性结构，与蛋白等成分互作形成了昆虫等节肢动物的体壁和中肠围食 膜，对保护这些生物的内部器官、防止外源毒素和病原体入侵起到了重要作用[1,2]。几丁质 是由葡糖胺经 β-1,4 方式连接形成的聚合物，催化该反应的酶是几丁质:UDP-乙酰葡糖胺糖 基转移酶(EC 2.1.1.4)，又称几丁质合成酶（Chitin synthase, CHS）。 由于 CS 是一种大分子量的膜蛋白[3]，分离和纯化非常困难，至今尚未有获得昆虫 CS 纯酶的研究报道[4]。因此，目前对于该酶主要性质、催化机理以及与其它功能蛋白（酶）的 相互作用机制等仍停留在推测和理论水平，缺乏直接的科学证据；同时也使以 CHS 为靶标 的杀虫剂设计缺乏必要的理论指导。dsRNAi 技术是目前最为有效的基因功能研究手段之一 [5] 拟谷盗[8]、伊蚊[9]和烟草天蛾[4]等生物 CHS 基因功能研究中得到了应用。 核型多角体病毒可专一性侵染鳞翅目昆虫，但不能侵染脊椎动物，是一种非常安全的生 物农药，同时该病毒也是一种良好的真核表达载体[10]。通过合适的方式将外源基因插入病 毒基因组，经侵染昆虫，可将的携带外源基因在昆虫体内表达。该技术已在利用蝎子毒素基 基金项目：博士点基金（No.200803350093） 作者简介：梁月荣（1957.09-），男，教授，研究方向为茶树生物技术与资源利用 通信联系人：陆建良（1970.12-）男，副教授，研究方向为茶树生物技术与资源利用. E-mail: jllu@zju.edu.cn -1-  n 因[11]和鳞翅目选择性神经毒素基因[12]等进行高毒力病毒改造中得到应用。 本研究的主要目的在于，在成功克隆茶尺蠖 CHS 基因的基础上，选择 C