紫外检测 - (蛋白)胶层析法.ppt

凝胶用过后，有几种保存方法： 湿态保存：在水相中加防腐剂，或水洗到中性，高压灭菌封存（或低温存放）； 半收缩保存：水洗后滤干，加70％乙醇使胶收缩，再浸泡于70％乙醇中保存； 干燥保存：水洗后滤干，依次用50％、70％、90％、95％乙醇脱水，再用乙醚洗去乙醇，干燥(或60～80℃烘干）后保存。加乙醇时，切忌一上来就用浓乙醇处理，以防结块。 紫外检测仪 及记录仪 紫外检测仪是生物大分子液相色谱中常用的检测仪器，可用于连续测量液体流的紫外吸收，用与其相连接的记录仪记录下吸光值的变化情况，广泛应用于生物大分子的分离纯化。 一.北京新技术所生产的紫外检测仪及记录仪的使用： 1．仪器的连接：紫外检测仪出厂时安装280nm滤光片，使用前应确认波长转换开关在280nm处。用信号线将紫外检测仪和记录仪连接，分别开启电源。层析柱出口的导管接到检测仪的进样口（下口），检测仪的出样口（上口）与样品收集装置连接。 2．紫外检测仪的预热：将检测仪量程旋钮至T档位置，预热约1h。 3．记录仪的调整： （1）检测仪的输出电压为100mV，所以记录仪的量程放在100mV； （2）按下输入键，记录仪输入短路，用zero旋钮调节0mV，弹起zero键，与检测仪输出连接。注意在测定过程中保持记录仪和检测仪的连接状态，不能再调zero旋钮； （3）调整纸速2cm/h，开始记录时放下记录笔，按下开始键。 4．检测仪的调整： (1) 当缓冲液流入吸收池后，将灵敏度旋钮拨到T，调节透过率旋钮，使输出信号在90—95mV之间； 英国的称为Sagavac，又分为Sagavac 2F，4F，6F，8F，10F和2C，4C，6C，8C，10C。前面的阿拉伯数字表示凝胶中干胶的百分数，F代表粉末状，C代表颗粒状。 丹麦的称为Gelarose，有5种类型，即2％，4％，6%，8％和10％。 琼脂糖凝胶做成珠状后不再脱水干燥，否则不能再溶胀恢复原有形状，因此商品大都以含水状态供应，并应在湿态保存。一般悬浮在l0-3 mo1/L EDTA和0.02%叠氮化钠溶液中。百分数表示干胶量。 四、凝胶层析技术 （一）凝胶的选择与处理 选择适宜的凝胶是取得良好分离效果的最根本的保证。选取何种凝胶及其型号、粒度，一方面要考虑凝胶的性质，包括凝胶的分离范围（渗入限与排阻限）还有它的理化稳定性、强度、非特异吸附性质等；另一方面还要注意到分离目的和样品的性质。 凝胶粒度的大小对分离效果有直接的影响。—般来说，细粒凝胶柱流速低，但洗脱峰窄，分辨率高，多用于精制分离或分析等。粗粒凝胶柱流速高，但洗脱峰平坦，分辨率低，多用于粗制分离，脱盐等。下图表示在同一流速下不同粒度的Sephadex G-25柱的洗脱效果。 凝胶粒度与洗脱效果的关系图 对生物样品来说，经常遇到的是两种分离形式。一种是只将分子量极为悬殊的两类物质分开，如蛋白质与盐类，称作类分离或组分离。另一类则是要将分子量相差不很大的大分子物质加以分离，如分离血清球蛋白与白蛋白，这叫做分级分离。后者对实验条件和操作要求都比较高。下面以最常用的葡聚糖凝胶类为例，分别加以讨论 。 1．类分离 目的是分开样品中分子量悬殊的“较大分子组”和“较小分子组”两类物质，并不要求分离分子量相近的组分。 选择凝胶时，应使样品中大分子组的分子量大于其排阻限，而小分子组的分子量小于渗入限。也就是说大分子的分配系数Kd= 0，小分子的Kd＝1。这样能取得最好 的分离效果。例如从蛋白质溶液中除去无机盐。我们知道，蛋白质的分子量都大于5000D，而无机盐的分子量一般在几十到几百之间。所以常选用Sephadex G-25凝胶作为分离固定相，因为它的分离范围是1000～5000D。被分离的两组物质的分子量正好落在分离范围的两侧。大分子组为全排阻，而小分子组为全渗入，其Kd值的差可达最大值1。对于分子量小于5000D的肽类进行脱盐操作则常选用Sephadex G-15凝胶。 2．分级分离 目的是分开分子量不很悬殊的大分子物质。选择凝胶型号时必须使各种物质的Kd值尽可能相差大一些。为此，首先决不能使它们的分子量都分布在凝胶分离范围的一侧，也就是Kd不要都接近于0或1，而要使组分的分子量尽可能分布在凝胶分离范围的两侧，或接近两侧的位置。如果样品中含有3个组分的话，最好一个接近全排阻，另一个接近全渗入， 第三个为部分渗入，且分子量大于渗入限的3倍，并小于排阻限的1／3。因为分子量如与渗入限比较靠近，该组分分子在凝胶颗粒中运动所受的约束很小，不易与低分子组分分开。如分子量与排阻限比较靠近则不易与高分子组分分开。如用Sephadex G-200分离血清蛋白