生物化学检验常用技术.pptxVIP

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生物化学检验常用技术演讲人:日期:

01光谱分析技术02电泳分离技术03色谱分析技术04免疫检测技术05分子诊断技术06质谱分析技术目录CATALOGUE

光谱分析技术01PART

紫外-可见分光光度法原理与应用方法优势与局限仪器构成基于物质对紫外-可见光区(200-800nm)的选择性吸收特性,通过朗伯-比尔定律定量分析待测物浓度。广泛应用于核酸、蛋白质定量及药物纯度检测,如DNA/RNA的A260/A280比值测定。核心部件包括光源(氘灯/钨灯)、单色器、样品池、检测器(光电倍增管)及数据处理系统。需定期校准波长准确性和吸光度线性范围以确保数据可靠性。操作简便、成本低,但易受溶剂极性、pH值及共存杂质干扰,需通过空白对照和标准曲线法减少误差。

荧光光谱分析法高灵敏度检测利用物质受激发后发射荧光的特性,检测限可达纳克甚至皮克级,适用于痕量物质分析(如维生素、多环芳烃)。需优化激发/发射波长以排除背景荧光干扰。动态范围与猝灭效应荧光强度与浓度呈线性关系,但高浓度时可能因内滤效应或碰撞猝灭导致信号衰减,需稀释样本或使用同步荧光技术校正。联用技术拓展与高效液相色谱(HPLC)联用(HPLC-FLD),可分离复杂基质中的荧光物质,提升特异性,如食品安全中的黄曲霉毒素检测。

通过基态原子对特征谱线的吸收测定金属元素(如铅、汞、钙)含量,火焰原子化法适用于ppm级,石墨炉原子化法可达ppb级。需选择合适空心阴极灯及背景校正方式(如氘灯或塞曼效应)。原子吸收光谱法元素定量分析化学干扰(如磷酸盐对钙的抑制)可通过加入释放剂(镧盐)缓解;物理干扰(粘度差异)需匹配基体或采用标准加入法。干扰与消除被EPA、ISO等机构列为环境水样、生物组织重金属检测的权威方法,如血铅监测需严格遵循CLIA认证的质控流程。行业标准方法

电泳分离技术02PART

聚丙烯酰胺凝胶电泳高分辨率分离聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)能够根据蛋白质或核酸的分子量、电荷及构象差异实现高分辨率分离,尤其适用于小分子量蛋白质(10-300kDa)和寡核苷酸的精细分析。01凝胶孔径可调通过调整丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺的浓度比例,可控制凝胶孔径大小,从而适应不同分子量范围的分离需求(如变性电泳SDS或非变性电泳Native)。聚合方式多样化学聚合(过硫酸铵-TEMED催化)和光聚合(核黄素激发)两种方法可灵活选择,前者适用于常规实验,后者适用于对氧敏感的样品或低温环境。应用广泛除蛋白质分析外,还可用于DNA测序(尿素)、WesternBlot转印前处理及蛋白质复合物研究。020304

琼脂糖凝胶因其孔径较大(0.5%-3%浓度),更适合分离1kb至50kb的DNA或RNA片段,是分子生物学中PCR产物鉴定和基因组分析的核心技术。大分子核酸分离相比聚丙烯酰胺,琼脂糖毒性更低,且可通过熔点差异回收目标DNA片段(如低熔点琼脂糖用于DNA纯化)。低毒性支持介质无需聚合反应,加热溶解后冷却即可成胶,且电泳时间短(通常30-60分钟),兼容溴化乙锭(EB)或更安全的核酸染料进行可视化检测。操作简便快速010302琼脂糖凝胶电泳通过交替电场方向,可实现超大DNA分子(高达10Mb)的分离,用于染色体分析和病原体分型。脉冲场电泳扩展应用04

毛细管电泳技术支持自由溶液电泳(CZE)、胶束电动色谱(MEKC)和凝胶填充毛细管电泳(CGE),适用于蛋白质、核酸、小分子代谢物甚至离子分析。多模式分离机制????0104????03??02??常与质谱(CE-MS)或激光诱导荧光检测器(CE-LIF)联用,实现复杂生物样品的高通量、高特异性分析。联用技术优势利用内径50-100μm的毛细管作为分离通道,仅需纳升级样品即可完成分离,显著减少试剂消耗并提高灵敏度(检测限可达fmol级别)。高效微量化分析集成自动进样器和多毛细管阵列,可并行处理数十个样本,广泛应用于临床诊断(如血红蛋白变异检测)和二代测序片段分析。自动化与高通量

色谱分析技术03PART

高效液相色谱法(HPLC)采用高压泵推动流动相通过高精度色谱柱,能够实现复杂混合物中各组分的有效分离和定量分析,尤其适用于热不稳定、高沸点或大分子化合物的检测。高效液相色谱法高分离效能与精确分析HPLC在药物分析、食品安全、环境监测及生物医学研究中具有重要地位,如药物代谢产物检测、食品添加剂含量测定及环境污染物的痕量分析等。广泛应用领域根据检测需求可搭配紫外-可见光检测器(UV-VIS)、荧光检测器(FLD)或质谱检测器(MS),显著提升方法的灵敏度和特异性。多样化的检测器选择

气相色谱法挥发性化合物的高效分离气相色谱法(GC)通过载气带动样品在固定相中分配,适用于沸点低于400℃的挥发性或半挥发性有机物分析,如石油组分、农药残留及香料成

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