目的基因的分离和克隆课件.pptVIP

二、目的基因與載體的連接㈠粘性末端的連接1.單酶切點的粘性末端全同源性粘性末端⑴高背景⑵雙向插入,不能定向（如前圖2-5，2-6）2.雙酶切片段的定向克隆①粘－粘非同源互補的粘性末端重組方案中最有效簡捷的途徑。②粘－平㈡平端連接法1.同聚物加尾法2.用銜接物連接法3.適配子連接法（帶有相應酶切點的粘性末端）EcoRI粘性末端：5’－AGCGGCCGCG－3’TCGCCGGCGCTTAA－5’BamHI／PasI粘性末端：5’－GATCCGG…….CACTGCA－3’3’－GCC…….GTG－5’BamHIPasI4.T－A克隆法TaqDNA聚合酶在擴增目的基因DNA的同時,能不依賴範本而在擴增產物兩3’端加上兩個游離的“A”。目的基因目的基因：特定功能的基因與相應載體重組後能在宿主細胞中表達的DNA。相對宿主細胞稱外源基因。化學合成法用去氧單核苷酸按特定的已知序列以3’-5’磷酸二酯鍵的形成（採用縮合反應），逐個進行延伸達所需長度後，去除保護劑，再分離純化，即可獲得目的基因。二、聚合酶鏈反應1.原理：以DNA變性複製的某些特性為原理，以目的DNA片段為範本,利用酶促反應（Taq酶），在特定引物的引導下，將加入的4種dNTP由引物沿範本從5’→3’按堿基配對原則,形成與範本DNA互補的半保留複製鏈,新合成的鏈又可作為下一輪迴圈的範本。經25-30個迴圈產物呈2n指數擴增，由pg—μg（紫外可見），可獲得基因片段。（如圖）目的DNA片段:染色體DNART-PCR：cDNA2.應用：1）診斷①帶有異常外源基因（如病毒）②變異基因（腫瘤、遺傳病等）2）合成特異基因或目的基因3）合成特異探針3.特點：⑴反復迴圈便於獲得大量的基因拷貝⑵Taq酶作用下每一輪PCR迴圈會產生10－3～10－4的錯配率,所以多用於基因檢測，如果用於基因重組表達，在此之前必須進行DNA序列分析。???目的基因的分離和克隆第一節???????目的基因的獲得一、化學合成二、聚合酶鏈反應（PCR）方法擴增目的基因三、建立基因組DNA文庫四、構建cDNA文庫篩選目的基因五、其他方法一、化學合成法自動化DNA合成儀1.要求：1）已知目的基因的核苷酸序列或其對應的多肽鏈氨基酸序列2）較短的DNA片段，有專一性和定向性2.原理：第一個核苷酸固定於不溶性的固相載體上,然後按預定順序從該核苷酸開始，以3’、5’-磷酸二酯鍵與另一核苷酸進行縮合反應（封閉非反應基團），其後用洗滌法除去多餘的反應物和副產物,再用同樣的步驟與下一個核苷酸進行縮合反應,如此迴圈將合成的寡核苷酸鏈從載體上洗脫下來,解除保護基,進一步純化。應用範圍：1）合成PCR引物2）寡核苷酸探針3）人工接頭及較小的基因二、建立基因組DNA文庫基因組文庫：分離真核生物中某種DNA成分,通常是分離供體細胞中的染色體DNA，酶切後，將這些染色體DNA片段與某種載體相接，而後轉入大腸桿菌，建立包含有真核細胞染色體DNA片斷的克隆株,這種克隆株群體。1.特點：提供全套遺傳資訊,即完整的基因組DNA,可以研究基因組中5’端控制基因轉錄的調控序列,內含子的分佈和作用,以及重複序列的數量分佈及大小2.構建基因組文庫全過程（DNA重組的過程）⑴分離純化基因組DNA,提取哺乳動物細胞染色體DNA⑵製備全部基因組的DNA片斷①機械斷裂法用超聲波或高速攪拌DNA溶液斷裂片段兩端沒有與克隆載體匹配的粘末端,因此插入載體之前還需要進行修飾加工，少用②限制性內切酶降解（鳥槍法）過去用EcoRⅠ,現在用Sau3A斷裂片段兩端有與克隆載