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用堿處理或用RNaseH降解mRNA-DNA雜交分子中的mRNA。mRNAcDNA3’3’5’5’反轉錄酶引物mRNAcDNA第一鏈3’3’5’5’引物cDNA第一鏈3’5’引物②降解mRNA範本或RNaseH堿剩下的cDNA單鏈的3’末端一般形成一個彎回來的雙鏈髮卡結構（機理不明），可成為合成第二條cDNA鏈的引物。用DNA聚合酶合成第二鏈DNA.。cDNA第一鏈5’cDNA第二鏈合成DNA聚合酶cDNA第一鏈cDNA第二鏈5’3’③cDNA第二鏈合成④去掉髮卡結構核酸酶S1用核酸酶S1可以切掉髮卡結構（但這會導致cDNA中有用的序列被切掉！）。cDNA第一鏈cDNA第二鏈5’3’cDNA第一鏈cDNA第二鏈5’3’5’3’這種酶能識別mRNA-cDNA雜交分子中的mRNA，並將其降解成許多小片斷。妙用RNaseH小片斷正好成為DNA聚合酶的引物，用來合成岡崎片斷。DNAPolI除去引物並修補後再使用DNA連接酶連成一整條DNA鏈。mRNAcDNA3’5’反轉錄酶引物mRNAcDNA第一鏈3’5’引物mRNAcDNA第一鏈3’5’mRNAmRNADNA聚合酶DNA聚合酶cDNA第二鏈cDNA第一鏈3’5’RNaseHDNAligase去引物在雙鏈cDNA末端接上人工接頭，即可與載體連接，轉入受體菌。或借助末端轉移酶給載體和雙鏈cDNA的3’端分別加上幾個C或G，成為粘性末端。5.cDNA與載體連接：接上人工接頭粘性末端CCCCCC末端轉移酶6.cDNA文庫的大小一個cDNA文庫要包含99%的mRNA時所需要的克隆數目。N=ln(1-p)ln(1-)p:文庫包含了完整mRNA的概率（99%）:某一種低豐度（不足14份拷貝）mRNA占細胞整個mRNA的比例N：所需的重組載體數（克隆數）1n1n三、文庫的查詢（screening）用目的基因探針與文庫中的重組載體進行Southernblot雜交。文庫載體探針電泳後雜交放射自顯影測序分析目的基因的獲取目的基因：準備要分離、改造、擴增或表達的基因。第一節基因組DNA片斷化一、限制性內切酶法用限制性內切酶把基因組DNA切成不同大小的片斷。酶切由於帶有粘性末端，產物可以直接與載體連接。1.優點2.缺點目的基因內部也可能有該內切酶的切點。目的基因也被切成碎片！BamHIBamHIBamHIgene二、隨機片斷化1.限制性內切酶局部消化法控制內切酶的用量和消化時間，使基因組中的酶切位點只有一部分被隨機切開。①內切酶識別位點的堿基數影響所切出的產物的長度和隨機程度。（1）限制性內切酶的選用原則1）4bp的內切酶平均每46（4096）bp一個切點。2）6bp的內切酶平均每44（256）bp一個切點。隨機程度高。如HaeⅢ、AluI、Sau3A。②內切酶粘性末端能與常用克隆位點相連。（Sau3A—BamHI）2.機械切割法（1）超聲波超聲波強烈作用於DNA，可使其斷裂成約300bp的隨機片斷。（2）高速攪拌1500轉/分下攪拌30min，可產生約8kb的隨機片斷。1976年H.G.Khorana提出了用化學方法合成基因的設想，並於1979年在science上發表了率先成功地合成大腸桿菌酪氨酸tRNA基因的論文。第二節化學合成目的基因一、目前常用的方法磷酸二酯法、磷酸三酯法、亞磷酸三酯法、固相合成法自動化合成法。①保護dNTP的5’端P或3’端-OH③用酸或堿的脫保護（1）原理1.磷酸二酯法②帶保護的單核苷酸連接保證合成反應的定向進行。帶5’保護的單核苷酸與帶3’保護的另一個單核苷酸以磷酸二酯鍵連接起來。（2）合成過程下一個5’端保護的單核苷酸又可以同3’端保護的二核苷酸聚合。原理與磷酸二酯法一樣。只是參加反應的單核苷酸都是在3’端磷酸和5’-OH上都先連接了一個保護基團。2.磷酸三酯法將第一個核苷酸的3’-OH端固定在固相支持物上。固相磷酸三酯合成法是目前通用的合成方法。15合成的二核苷酸連接處有三個酯鍵！固相磷酸三酯合成過程固相支持物結果是全保護的DNA：5’DMT,3’固相支持物,核苷酸之間對氯苯。最後脫保護固相支持物固相支持物C化學合成的DNA片斷一般在200bp以內。二、化學合成DNA片斷的組裝用T4多核