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氧化苦参碱对烟曲霉菌性角膜炎治疗作用及其机制的研究

摘要

目的：研究氧化苦参碱(Oxymatrine，OMT）对烟曲霉菌（Aspergillusfumigatus,A.

fumigatus）性角膜炎的治疗效果及抗真菌作用机制。

方法：1.最低抑菌浓度实验来验证OMT对烟曲霉菌分生孢子的抑制作用；钙荧光白

染色实验、生物膜形成实验、山梨醇保护实验、碘化丙啶摄取实验和分生孢子粘附实

验来检测OMT对生物膜形成、细胞壁及细胞膜完整性的影响；2.CCK-8实验来检测

OMT对人角膜上皮细胞（humancornealepithelialcells,HCECs）和小鼠巨噬细胞

RAW264.7OMT

（）活力的影响，应用角膜荧光素染色实验评估对正常小鼠角膜的

毒性作用；3.建立烟曲霉菌感染的C57BL/6小鼠角膜炎动物模型，对小鼠模型给予PBS

或OMT点眼治疗，采用平板菌落计数法、苏木精-伊红染色方法和临床评分评估OMT

对小鼠烟曲霉菌性角膜炎模型的治疗效果。采用髓过氧化物酶法和免疫荧光染色法检

测OMT对中性粒细胞和巨噬细胞的浸润情况。应用RT-PCR检测OMT对真菌感染过

IL-1βIL-18caspase-1NLRP3GSDMDmRNA

程中焦亡相关水平、、、和的表达水平，

应用ELISA检测炎症因子IL-1β、IL-18的蛋白表达水平，应用westernblot检测

caspase-1NLRP3GSDMDNrf24.

、和、的蛋白表达；建立烟曲霉菌刺激的原代巨噬细

胞模型，收集PBS或OMT处理8h及24h后的原代巨噬细胞，应用RT-PCR检测IL-18、

IL-1β、caspase-1、NLRP3和GSDMD的mRNA表达水平，应用ELISA和westernblot

检测相关蛋白表达；5.Nrf2抑制剂预处理原代巨噬细胞，给予PBS或1.6mg/mLOMT

处理，收集烟曲霉菌刺激后24h的细胞，应用ELISA和westernblot检测IL-1β、IL-18、

Nrf2caspase-1NLRP3GSDMD

、、和的蛋白表达水平变化。

结果：1.OMT在浓度为0.64mg/mL时，OMT开始对烟曲霉菌产生抑制作用，随着浓

度的增加，效果更加显著；与对照组相比，OMT处理组烟曲霉菌的生物膜形成减少，

破坏了真菌细胞壁完整性，显著减少了烟曲霉分生孢子对HCECs表面的粘附作用。

2.OMT在1.6mg/mL以下，RAW264.7的细胞存活率在90%以上，在HCECs中，OMT

浓度在2.24mg/mL以下对细胞生长无明显抑制作用。OMT低于2.4mg/mL在小鼠角

膜上无明显毒性，小鼠角膜上皮完整；3.OMT有效降低角膜真菌负荷，并且降低炎症

程度。与PBS组相比，感染3天和5天的OMT组小鼠表现出角膜混浊程度降低以及

3

溃疡面积减少，临床炎症评分降低，角膜菌落计数减少，炎症反应减轻；感染天的

OMT4.

组减少中性粒细胞和巨噬细胞的募集；在原代巨噬细胞和小鼠烟曲霉菌性角膜

炎模型中，与PBS组相比，OMT处理组显著上调了Nrf2的蛋白表达以及下调IL-18、

I

IL-1β、caspase-1、NLRP3、GSDMD的mRNA和蛋白表达水平。Nrf2抑制剂预处理

OMTIL-1βIL-18caspase-1NLRP3GSDMD

原代巨噬细胞，上调了抑制的、、、