第七章 克隆基因的表达及基因干扰.pptVIP

四、表达产物的鉴定

第29页，共72页，星期日，2025年，2月5日四、表达产物的鉴定

第30页，共72页，星期日，2025年，2月5日第三节基因表达干扰技术第31页，共72页，星期日，2025年，2月5日第三节基因表达干扰技术二、核酶与脱氧核酶三、小干扰RNA四、微RNA一、反义核酸技术第32页，共72页，星期日，2025年，2月5日一、反义核酸技术（二）反义RNA技术（三）反义核酸技术的应用（一）反义寡核苷酸技术第33页，共72页，星期日，2025年，2月5日一、反义核酸技术（一）反义寡核苷酸技术1.反义寡核苷酸的作用机制2.反义寡核苷酸的设计与合成3.反义寡核苷酸的修饰4.反义寡核苷酸的给药途径第34页，共72页，星期日，2025年，2月5日一、反义核酸技术（一）反义寡核苷酸技术1.反义寡核苷酸的作用机制(1)抑制mRNA的翻译(2)抑制复制或转录(3)抑制蛋白质的加工、修饰及功能表达第35页，共72页，星期日，2025年，2月5日一、反义核酸技术2、反义寡核苷酸的设计与合成1）设计①计算机软件预测RNA的二级结构②利用寡核苷酸随机文库鉴别mRNA上的RNaseH切割位点、寡核苷酸芯片的扫描分析、随机寡核苷酸库结合逆转录分析法等对自然折叠的mRNA进行设计第36页，共72页，星期日，2025年，2月5日一、反义核酸技术2）合成①长度一般为15～25个核苷酸②G-C含量为60%～65%第37页，共72页，星期日，2025年，2月5日一、反义核酸技术3.反义寡核苷酸的修饰最常见的是对ASON的骨架中的磷酸基团进行修饰（1）硫原子代替磷酸二酯中的氧原子（2）甲基修饰磷酸骨架（3）聚酰胺键代替磷酸骨架第38页，共72页，星期日，2025年，2月5日一、反义核酸技术4.反义寡核苷酸的给药途径（1）直接作用于培养细胞（2）结合L-多聚赖氨酸或脂质体进入细胞（3）动物模型则可通过静脉、腹腔、皮下、肌肉、瘤体内注射或气雾吸入等途径第39页，共72页，星期日，2025年，2月5日一、反义核酸技术（二）反义RNA技术

1.反义RNA的作用机制2.反义RNA的设计第40页，共72页，星期日，2025年，2月5日（二）反义RNA技术

1.反义RNA的作用机制(1)抑制DNA复制(2)阻止目的mRNA的成熟及向胞浆内转运(3)抑制mRNA翻译(4)使mRNA更易被核酸酶识别而降解一、反义核酸技术第41页，共72页，星期日，2025年，2月5日一、反义核酸技术2.反义RNA的设计与ASON相比，反义RNA的设计较为简单第42页，共72页，星期日，2025年，2月5日（三）反义核酸技术的应用需要完善或解决的问题：①防止被核酸酶降解②需要进一步了解寡核苷酸进入细胞的确切机制③很多寡核苷酸易发生序列特异性和非序列特异性的结合④ASON是否会影响正常细胞的基因表达⑤用载体导入反义RNA在体内表达时，存在安全性和转染效率不高等问题一、反义核酸技术第43页，共72页，星期日，2025年，2月5日二、核酶与脱氧核酶（一）核酶（二）脱氧核酶第44页，共72页，星期日，2025年，2月5日二、核酶与脱氧核酶（一）核酶1.核酶的分类2.核酶的结构3.核酶的设计与修饰4.核酶转移方法5.核酶的应用第45页，共72页，星期日，2025年，2月5日二、核酶与脱氧核酶（一）核酶1.核酶的分类（1）大分子核酶：第Ⅰ类内含子、第Ⅱ类内含子、核糖核酸酶P（2）小分子核酶：锤头状RNA、发夹形RNA、肝炎D病毒RNA和neurosporaVarkudsatellite核酶第46页，共72页，星期日，2025年，2月5日2.核酶的结构（1）锤头状核酶：二级结构有三个螺旋环结构区和一个催化中心二、核酶与脱氧核酶第47页，共72页，星期日，2025年，2月5日（2）发夹形核酶：每个结构域由螺旋-环-螺旋组成二、核酶与脱氧核酶第48页，共72页，星期日，2025年，2月5日二、核酶与脱氧核酶（二）脱氧核酶1.脱氧核酶的结构种类及特征2.脱氧核酶的催化特性3.设计合成脱氧核酶的原则4.脱氧