克隆基因的表达课件.pptVIP

（2）杆狀病毒的表達特點①感染後36-48h，病毒開始合成大量的多角蛋白。②多角蛋白的啟動子特別強。③多角蛋白基因可以被替換掉而不影響病毒的繁殖。多角體基因被外源基因取代後，病毒仍然能形成有感染能力的病毒粒子，但不能形成多面體。3.轉化子篩選通過顯微鏡檢查看是否有多面體形成。源自草地夜蛾的細胞株，在這種細胞中，多角蛋白的啟動子特別活躍。2.最普遍應用的宿主細胞株（1）轉移載體的構建大腸桿菌質粒，插入兩段AcMNPV序列以供同源重組。4.杆狀病毒轉化載體杆狀病毒的基因組太大（13kb環狀DNA），不能直接插入。必須使用同源重組的辦法。多角蛋白的啟動子和終止子及polyA加尾信號。啟動子與終止子之間插入多克隆位點轉移載體（2）杆狀病毒載體轉化過程①轉移載體中插入外源基因②轉移載體與野生型AcMNPVDNA共同轉染宿主細胞③轉移載體與病毒基因組發生雙交換④外源基因被交換轉入病毒基因組中⑤重組病毒侵染宿主4-5天後即可收穫重組蛋白。4.目前已經用杆狀病毒在真核生物細胞中表達的外源蛋白外源蛋白外源蛋白α干擾素腺苷酸脫氫酶β澱粉酶前體蛋白β干擾素Bluetonguevirus中和抗原紅細胞生成素HIV-1外殼蛋白流感病毒凝集素白細胞介素2Lassavirus蛋白鼠單克隆抗體脊髓灰質炎病毒蛋白類狂犬病病毒蛋白狂犬病病毒糖蛋白Simianrotavirus外殼蛋白抗原組織型纖溶酶原啟動劑5.杆狀病毒大規模表達存在的問題杆狀病毒侵染昆蟲幼蟲，在幼蟲體內表達外源蛋白，成為“低成本蛋白工廠”。22只粉蚊夜蛾幼蟲4天後表達的人腺苷酸脫氫酶占幼蟲總蛋白的2%-5%。共產出9mg很純的產物。（1）壽命短感染4-5天後宿主細胞裂解或幼蟲死亡。（2）共同轉染率低重組率更低。0.1%-1%。6.構建可持續表達的載體利用AcMNPV的一個早期基因IE1的啟動子。IE1基因的轉錄不依賴與病毒的其他基因產物，而且在昆蟲細胞中表達正常。把外源基因插入到IE1啟動子和IE1終止子之間。構成整合型載體。載體轉染宿主細胞後隨即整合到宿主染色體上，實現外源蛋白的持續表達。載體IE1啟動子外源基因IE1終止子載體三、外源基因在植物中表達根瘤存在於能引起植物形成冠癭瘤的土壤農桿菌中，誘導冠癭瘤形成，又稱腫瘤誘導質粒（tumorinducingplasmid）。1.Ti質粒:（1）O-糖基化（Ser,Thr）3.蛋白質糖基化糖基（2）N-糖基化（Asn）Dol：長醇Mannose：甘露糖Glucose：葡萄糖N-AcGlc：N乙醯氨基葡萄糖磷酸化、乙醯化、硫酸化、丙烯酸化、羰基化、豆冠酸化、軟脂化4.氨基酸殘基的修飾羥脯氨酸甲基組氨酸羥賴氨酸羧基谷氨酸缺乏蛋白質的加工。（如糖基化、氨基酸修飾等）。十、原核細胞表達的缺陷酵母菌、植物原生質體、動物培養細胞等。第二節外源基因在真核細胞中的表達真核或病毒啟動子MCSPolyA信號終止子外源基因①能在E.coli中克隆和擴增。1.酵母克隆載體一、在酵母中表達Leu2+、His+、Ura3+、Trp1+;④有合適的克隆位點。③有酵母的選擇標記Ori②有大腸桿菌的選擇標記Ampr、Tetr。DividingSaccharomycescerevisiae(baker’syeast)cells由大腸桿菌質粒和酵母的DNA片斷（選擇標記）構成。ColE1酵母Leu2+如PYeleu10:（1）整合型載體(YIp)①轉化率低（1-10轉化子/微克DNA）。特點：載體上只有細菌的複製區，沒有酵母的自主複製區。可與受體細胞的染色體DNA同源重組，隨染色體一起複製。②不能在酵母細胞中自主複製③整合到酵母的染色體上④不能從酵母細胞中提取載體。由大腸桿菌質粒和酵母的DNA片斷(選擇標記和酵母DNA自主複製順序ARS）構成。大腸桿菌質粒酵母ARS（2）複製型載體(YRp)酵母選擇標記ARSARS（automouslyreplicatingsequence）:ATTTTATATTTATGT250bp保守區特點：①轉化率高（102-103轉化子/微克DNA)。④不穩定，容易丟失。②可從大腸桿菌和酵母中提取質粒。既能在大腸桿菌中複製，又能在酵母細胞中自主複製。③穿梭載體（shuttlevector）在YRp質粒中插入酵母染色體的著絲粒區。特點：