外源基因在毕赤酵母中表达水平的预测.pptVIP

垂直电泳系统第29页，共50页，星期日，2025年，2月5日蛋白转膜系统第30页，共50页，星期日，2025年，2月5日阳极阴极滤纸凝胶膜多孔垫片转膜系统各组件及其位置第31页，共50页，星期日，2025年，2月5日NGAL（neutrophilgelatinase-associatedlipocalin）即中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白，是脂质运载蛋白（lipocalin)家族的一个成员。NGAL基因的蛋白产物具有保护调节基质金属蛋白酶-9的活性，作为小分子铁配合物结合蛋白参与机体铁代谢和天然免疫反应等功能。另外，NGAL作为一种早期标志物还可以帮助判定缺血性肾损伤程度。NGAL的mRNA信息在NCBI核酸数据库中有来自不同实验室登记的多个版本，包含完整编码区的有BC033089和NM_005564等，编码区长为597bp，编码198个氨基酸，包含了N端前部长为20个氨基酸的信号肽序列（为核酸序列的1-60bp）。NGAL基因的简介第32页，共50页，星期日，2025年，2月5日NGAL核酸编码区序列及其相应的蛋白序列：第33页，共50页，星期日，2025年，2月5日由N端的310螺旋、C端的α螺旋和中间的八段反平行式β折叠构成了一个β折叠桶结构；在β折叠桶底部内侧排列着疏水的芳香族和脂肪族氨基酸残基，形成了一个疏水核或疏水内部，为结合亲脂性配体提供了位点；NGAL在其β折叠桶封闭端的β4-β5环上有游离的巯基(C87)，这可使NGAL与一些蛋白质分子，如MMP-9，形成分子间二硫键，并以此来调节这些蛋白的功能或活性。NGAL的蛋白三级结构（图为NGAL蛋白的同源二聚体）：第34页，共50页，星期日，2025年，2月5日以往，汕头大学医学院生物化学与分子生物学教研室李恩民教授课题组利用大肠杆菌原核表达系统获得了NGAL蛋白，但是由原核表达系统对外源蛋白没有类似真核细胞中的蛋白修饰，如磷酸化和糖基化，有可能影响这些蛋白在功能研究实验中的效果，为此，我们选择了毕赤酵母这种真核表达系统来表达NGAL蛋白。由大肠杆菌表达获得的NGAL蛋白第35页，共50页，星期日，2025年，2月5日本文由探生科技技术人员提供,Fantibody全球抗体有哪些信誉好的足球投注网站引擎，您身边的抗体专家!外源基因在毕赤酵母中表达水平的预测第1页，共50页，星期日，2025年，2月5日

第一部分：外源基因在毕赤酵母中高效表达的预测第二部分：毕赤酵母蛋白表达产物的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离分析鉴定第三部分：分析其他目的基因在毕赤酵母中高效表达的概率此实验共包括如下三个部分第2页，共50页，星期日，2025年，2月5日在科研和临床中需要大量的蛋白质，这些蛋白不可能由人体组织或体外细胞培养而大规模的获得，人们利用一些低等生物的特点，来生成和获得这些人属蛋白质。酵母菌是单细胞真核生物，具有生长快、易于遗传操作、能对外源蛋白进行翻译后加工和修饰、不产生有毒产物等特点，被认为是表达外源蛋白的合适宿主。几种工业酵母尤其是巴氏毕赤酵母(pichiapastoris,Pp)，因具有旺盛的生长力以及其它一些独特的性质，已发展成为较成熟的蛋白生产的表达系统。毕赤酵母以甲醇为营养来源。由毕赤酵母表达应用于临床的蛋白目前有胰岛素，乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、肿瘤坏死因子(TNF)、表皮生长因子(EGF)、人血清白蛋白，以及多种抗体等。第一部分：外源基因在毕赤酵母中高效表达的预测第3页，共50页，星期日，2025年，2月5日微观的酵母细胞第4页，共50页，星期日，2025年，2月5日5AOX1启动子片段含有AOX1启动子，在甲醇的诱导下可启动外源蛋白的表达；α-因子信号肽序列为约89个氨基酸的信号肽序列，能使外源蛋白分泌到发酵上清中，更利于外源蛋白的纯化；多克隆位点含多个酶切位点，为外源基因的插入提供位点；TT序列提供有效的转录终止和polyA修饰信号；HIS4为营养缺陷型筛选标志；3AOX1基因片段能够与基因组AOX1基因属同源重组；抗Amp基因和pBR322能使空载体和构建的表达载体在E.coli中筛选和复制。毕赤酵母表达系统中常用载体的基本结构第5页，共50页，星期日，2025年，2月5日pPIC9载体的信号肽序列和多克隆位点第6页，共50页，星期日，2025年，2月5日1.载体的3AOX1区与基因组的AOX1基因的末端发生整合重组表达载体与毕赤酵母基因组发生重组的两种方式：2.载体的HIS4区与基因组的HIS4基因的末端发生整合重组第7页，共50页，星期日，2025年，2月5日甲醇酵母系统高效表达影响因素载体稳定