噬菌体溶藻关键酶LysV208的基因重组表达、纯化及溶藻活性测定.docxVIP

噬菌体溶藻关键酶LysV208的基因重组表达、纯化及溶藻活性测定

目录

一、内容概要．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．3

1.1研究背景与意义．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．4

1.1.1水华问题的严峻性．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．5

1.1.2噬菌体溶藻机制的探索．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．7

1.1.3LysV208酶的作用及其重要性．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．7

1.2国内外研究现状．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．10

1.2.1噬菌体研究进展．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．12

1.2.2溶藻蛋白研究进展．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．13

1.2.3LysV208酶研究进展．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．16

1.3研究内容与目标．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．19

1.3.1本研究的主要工作．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．21

1.3.2本研究的预期目标．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．21

二、噬菌体LysV208酶的基因克隆与表达．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．23

2.1实验材料与试剂．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．23

2.1.1菌种与噬菌体．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．26

2.1.2主要试剂．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．27

2.1.3主要仪器设备．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．29

2.2噬菌体LysV208基因的克隆．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．32

2.2.1引物设计与合成．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．35

2.2.2噬菌体基因组DNA提取．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．36

2.2.3PCR扩增LysV208基因．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．41

2.2.4基因片段的回收与连接．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．46

2.3LysV208基因的重组表达．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．46

2.3.1表达载体的构建．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．50

2.3.2重组表达菌株的筛选．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．51

2.3.3LysV208酶的表达条件优化．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．52

2.3.4LysV208酶的可溶性表达分析．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．55

三、重组LysV208酶的纯化与鉴定．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．56

3.1纯化策略的确定．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．58

3.2重组LysV208酶的纯化．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．61

3.2.1盐浓度梯度洗脱．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．63

3.2.2疏水层析纯化．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．65

3.3纯化酶的鉴定．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．68

3.3.1SDSPAGE电泳分析．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．69

3.3.2酶活性测定．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．70

3.3.3MALDITOF质谱分析．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．．73

3.3.4圆二色谱(CD)分析．．．．．．．．．．