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油橄榄内生真菌的分离鉴定及其抑菌活性研究

中图分类号：S182文献标志码：A文章编号：1002-1302（2025）11-0277-08

油橄榄（OleaeuropaeaL.）属于木樨科木樨榄属的一种常绿乔木，主要适生区在地中海沿岸，包括希腊、意大利、西班牙、突尼斯等国都是重要生产地[1]。我国自20世纪60年代引种成功后，主要在西北、西南发展种植，其中甘肃省陇南市的油橄榄种植面积和鲜果产量均居全国第—[2-4]。油橄榄也是一种木本油料树种，用其鲜果直接榨取的橄榄油富含不饱和脂肪酸、角鲨烯、植物淄醇、酚类物质和一些微量元素，具有抗氧化、抗肿瘤、抗菌等功效，营养价值极高，被誉为“液体黄金”[5]。除此之外，油橄榄果实也可应用于医药化工、食品保健等行业，具有极高的经济效益和社会效益[6]。植物内生真菌分布广，种类多，在植物体内普遍存在，但其不会造成宿主植物的感染发病症状，它与植物之间的关系经过长期的协同进化，对宿主植物的健康至关重要[7。目前已报道由内生真菌产生的具有生物活性的次生代谢产物超过20000种，从中寻找具有抗菌、抗氧化、抗肿瘤等开发潜能的生物活性物质，在医药开发、生物防治、研究对植物的诱导抗性方面，受到人们越来越多的关注[8-10]。通过对油橄榄内生真菌的分离与培养，可以获得丰富的真菌资源，然后研究其次生代谢产物，期望能够分离检测到活性较好的化合物，从而为植物真菌资源的开发与利用提供依据和指导。

油橄榄内生真菌研究主要集中在国外，研究人员通过多种方法对油橄榄不同部位中内生真菌的多样性进行了广泛研究，发现油橄榄内生真菌种类和数量在不同的品种、季节、地理位置和植物部位间差别较大，其次生代谢产物在抗菌、抗肿瘤方面报道较多[1l-13]。Martins等研究了油橄榄花与果实中内生真菌在保护寄主植物免受炭疽病侵害时的潜在作用，并确定了对油橄榄炭疽病具有生物防治潜力的候选菌株，证明了油橄榄内生真菌丰富度与炭疽病的发病率有关[14]。Malhadas等研究了3株从油橄榄叶片中分离得到的内生真菌对大肠杆菌等病原菌的抑制作用，强调次生代谢产物中的挥发性成分3-甲基-1-丁醇和苯乙醇具有抗菌潜力[15]。Mady等从埃及采集到的油橄榄叶片中分离得到的内生真菌产黄青霉（Penicilliumchrysogenum），其次生代谢产物吲哚生物碱被证明对人类乳腺癌细胞的增殖具有良好的抑制作用[16]。Liarzi等从油橄榄中分离出1株内生的炭球菌近似种Daldiniacf.concentrica，其次生代谢产物不仅有抑菌作用，而且对根结线虫有杀灭作用[17]。李勇杰等分析了云南引种油橄榄嫩叶中抗氧化成分含量，但截至目前，国内对本土油橄榄内生真菌的研究尚是空白，对其次生代谢产物也未见报道[18]。本研究采用组织分离法分离油橄榄内生真菌，测定其次生代谢产物的抗菌活性并对抑菌活性物质进行粗提作高效液相色谱（HPLC）分析，从中筛选出具有抗菌活性的菌株，为油橄榄内生真菌资源的下一步研究做基础。

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1供试材料2023年10月初健康油橄榄枝条、根、叶片均采自甘肃省陇南市武都区两水镇大湾沟油橄榄种植基地。

1.1.2供试植物病原菌桉树青枯病菌Ralstoniasolanacearum（）、番茄疮痂病菌Xanthomonasvesicatoria（G-）、枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis（G+）和溶血葡萄球菌Staphylococcushaemolyticus（G+），由华南农业大学林学与风景园林学院植物和微生物健康实验室提供。成团泛菌Pantoeaagglomerans（G-）和黄单胞杆菌Xanthomonasarboricola（G-）由甘肃省陇南市经济林研究院实验中心提供。

1.1.3主要试剂乙酸乙酯（分析纯，天津富宇精细化工有限公司）；石油醚（分析纯，天津富宇精细化工有限公司）；GF254薄层层析硅胶板（青岛海洋化工有限公司）；噻唑蓝（MTT）生物显色剂（Amresco公司）；硫酸链霉素（Sigma公司）。

1.2试验方法

1.2.1内生真菌的分离和纯化将油橄榄枝条、根、叶片分别用清水洗净，内生真菌的分离纯化采用Shan等的方法[19]。将枝条和根去除表皮，分成约0.5cm×0.5cm×0.5cm大小的块段，将叶片叶脉周围部分切为0.5cm×0.5cm片状。取第3次漂洗的无菌水2mL涂布于PDA培养基中，并在相同条件下培养作为对照，若没有真菌生长，说明消毒彻底。

1.2.2内生真菌的鉴定形态学的鉴定主要是观察菌丝特征和菌落形态。

分子生物学的鉴定具体方法如下：将保种的内生真菌接种到PDA培养基活化后再接种至含有20mL液体培养基（PDB）的三角瓶（规格