细胞工程第四章.pptVIP

抗体是由B细胞受抗原刺激后所分泌的蛋白质。抗体分子：由四条肽链所组成，两条重链（H链）两条轻链（L链）。结合区：抗体分子上有两个抗原结合区可变区（V区）稳定区（C区）第30页，共60页，星期日，2025年，2月5日人体内的五种抗体第31页，共60页，星期日，2025年，2月5日4.32单克隆抗体的制备单克隆抗体(monoclonalantibody，简称McAb)：将能够产生抗体的B淋巴细胞和具有无限增殖力的骨髓瘤细胞融合在一起，形成杂交瘤细胞。杂交瘤细胞既能在体外快速生长，又能持续分泌成分单一的特异性抗体。这种单一类型的只针对某一特定抗原决定簇的抗体分子，就是单克隆抗体。第32页，共60页，星期日，2025年，2月5日单抗的制备过程动物免疫与亲本细胞的选择细胞融合：淋巴细胞杂交瘤的制备杂交瘤细胞的筛选：有限稀释法等单克隆抗体的制备和冻存单克隆抗体的纯化第33页，共60页，星期日，2025年，2月5日亲本细胞的选择骨髓瘤细胞：一般不分泌抗体，能在体外无限繁殖和连续继代培养，且为HPRT－或TK－。多用BALB/C小鼠的骨髓瘤细胞。第34页，共60页，星期日，2025年，2月5日淋巴细胞：经过免疫处理的淋巴细胞，多用大鼠或小鼠。免疫方法：体内法或体外法。体内法：对细胞或微生物抗原可直接注射如小鼠体内，可溶性蛋白抗原可与等量的福氏完全佐剂混合乳化后，注入到动物体内。3－4天后，在无菌条件下可以取出脾或淋巴结制成悬液，存活率在95％以上的可以用于融合。体外法：直接提取大、小鼠淋巴细胞，调整为107个/ml，加适当浓度抗原，3－4天后，收集被刺激的淋巴细胞。第35页，共60页，星期日，2025年，2月5日细胞融合将免疫脾细胞和小鼠骨髓细胞以2：1或10：1的比例混匀于50ml锥形离心管内，1200rpm离心7—10分钟，尽量吸净上清液，用手指轻击管壁，使管底沉淀的细胞铺展成薄层，在室温条件下边轻轻振摇离心管边在60秒钟内逐滴加入50%的PEG0.5ml，随后静置90秒，再于5分钟内边振摇边逐滴加入5－10ml不含血清的培液或盐水缓冲液，以终止PEG的作用，再静置10分钟。第36页，共60页，星期日，2025年，2月5日HAT培养基筛选杂交瘤细胞细胞团块分散后，加HAT溶液，稀释至骨髓瘤细胞不超过2×105ml，即可加入有饲养细胞的96孔塑料培养板内每孔0.1ml，如是24孔板，每孔0.5ml；总量分别为0.2ml和1ml。用HAT选择性培养时每隔2－3天半量换液，7天后可以选择出杂交瘤细胞。第37页，共60页，星期日，2025年，2月5日细胞融合的选择示意图第38页，共60页，星期日，2025年，2月5日HAT选择系统HAT是含一定浓度次黄嘌呤（H）、氨基喋呤（A）及胸腺嘧啶核苷（T）的一种选择性培养基，其中三种成分与细胞DNA合成有关。DNA合成途径有两种。第39页，共60页，星期日，2025年，2月5日杂交瘤技术中，常选用次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶缺陷（HPRT-）骨髓瘤细胞或胸腺嘧啶核苷激酶缺陷型（TK-）骨髓瘤细胞为亲本之一。HPRT-细胞的嘌呤只能由全合成途径产生；TK-细胞的嘧啶只能由全合成途径合成。含氨基喋呤培养基抑制了细胞内嘌呤和嘧啶的全合成途径。第40页，共60页，星期日，2025年，2月5日嘌呤合成通路的阻断第41页，共60页，星期日，2025年，2月5日淋巴细胞具有合成DNA的两条途径。杂种细胞通过互补作用获得HRPT或TK基因，可应用培养基中次黄嘌呤及胸腺嘧啶核苷，通过补救合成途径合成DNA。在HAT培养基中，HPRT-或TK-亲本细胞死亡，淋巴细胞亦逐渐死亡，只有杂种细胞存活。第42页，共60页，星期日，2025年，2月5日第1页，共60页，星期日，2025年，2月5日4.1细胞融合4.2杂种细胞的遗传特性和应用4.3淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体技术第2页，共60页，星期日，2025年，2月5日4.1细胞融合4.11聚乙二醇介导的细胞融合4.12细胞电融合4.13杂种细胞的筛选第3页，共60页，星期日，2025年，2月5日第4页，共60页，星期日，2025年，2月5日4.11聚乙二醇（PEG）介导的细胞融合原理：PEG带有大量的负电荷,和原生质体表面的负电荷在钙离子的连接下，形成静电键，促使异源的原生质体间的粘着和结合，在高pH,高钙离子的溶液的作用下，将钙离子和与质膜结合的PEG分子洗脱，导致电荷平衡失调并重新分配，使两种原生质体上的正负电荷连接起来，进而形成具有共同质膜的融合体。第5页，共60页，星期日，2025年，2月5日第6页，共