电子显微镜免疫组织化学技术.pptVIP

艾滋病患者血清的免疫电镜所见。在病毒颗粒表面可见铁蛋白颗粒的吸附。在细胞质的空泡内可见到大量的与细胞外所见相同的病毒颗粒。第30页，共45页，星期日，2025年，2月5日培养的成纤维细胞质膜对LDL的内吞作用LDL颗粒与含铁的转铁蛋白共价相连，电子显微镜下所见的黑点是小分子的铁。（a）LDL与细胞表面的受体结合并形成有网格蛋白包被的小窝；（b）含有LDL的被膜小窝向下凹陷逐渐形成被膜小泡；（c）含有转铁蛋白标记的LDL被膜小泡；（d）含有转铁蛋白标记的LDL颗粒的无被小泡（初级内体）。第31页，共45页，星期日，2025年，2月5日（2）免疫染色方法常采用包埋前免疫染色，分为直接法和间接法。（1）直接法：切片直接浸于标记的特异性抗体内，室温或37℃1～2h以上；缓冲液浸漂，除去未结合的标记抗体溶液；再按常规电镜后固定、脱水、包埋。第32页，共45页，星期日，2025年，2月5日第1页，共45页，星期日，2025年，2月5日第2页，共45页，星期日，2025年，2月5日一电镜免疫组织化学技术概述二几种常用的透射电镜方法要点第3页，共45页，星期日，2025年，2月5日一电镜免疫组织化学技术概述特异性抗体用电子致密物质，如铁蛋白、胶体金等标记后，使之与组织超薄切片中的抗原结合，在电镜下观察到标记物所在位置，即为抗原抗体反应的部位。（一）组织固定与取材（二）免疫染色（三）包埋（四）对照试验第4页，共45页，星期日，2025年，2月5日（一）组织固定与取材原则：既要保存良好的细胞超微结构，又要注意保持组织的抗原性。固定：固定剂的要求：①不损害细胞内抗原的活性；②固定速度快、效果好；③分子量小，易于渗透；④固定后,不引起交联，造成空间的阻碍，影响标记抗体进入抗原位。第5页，共45页，星期日，2025年，2月5日影响固定的因素有：①固定剂的种类；②固定剂的浓度，浓度过大，对抗原的活性有影响，浓度过小，固定效果差；③固定剂的pH；④固定剂的温度,一般采用2℃～4℃冷固定；这样能降低细胞自溶作用和水分抽提；⑤固定时间与温度有关，温度高，固定快，也与缓冲系的离子强度有关，离子强度大，渗透压大，穿透力强，固定要快。不同的固定剂，或同一固定剂的不同浓度所需的固定时间也不一致；⑥与被固定的细胞类型有关。第6页，共45页，星期日，2025年，2月5日选用固定剂不宜过强。常采用灌注固定法。多聚甲醛—戊二醛混合液过碘酸—赖氨酸一多聚甲醛液(PLP液)：对含糖类丰富的组织固定效果特佳。（使用前必须用已知效价的抗原做一系列预实验。如固定剂的种类浓度、温度、pH及固定时间等。然后做出预处理的效价，作为失活参考以再选择最适条件。）取材：免疫电镜技术较光镜免疫化学技术要求更迅速、精细。灌流后需续固定：四氧化锇第7页，共45页，星期日，2025年，2月5日（二）免疫染色包埋前染色包埋后染色超薄切片免疫染色第8页，共45页，星期日，2025年，2月5日1包埋前染色即先行免疫染色，在解剖显微镜下将免疫反应阳性部位取出，修块；常规电镜方法处理，经锇酸固定、脱水、树脂包埋。特异性免疫反应的范围太小，可作二次包埋：即第一次包埋时将组织置于两层塑料片之间，中夹环氧树脂如夹心面包式，进行高温聚合，然后在解剖显微镜下取出需要部位作第二次包埋。第9页，共45页，星期日，2025年，2月5日包埋前染色的组织，以中层较为理想。表层因受机械修整，结构保存不好，深层因抗体不能透入，免疫反应弱或无。半薄切片可在相差显微镜下不染色观察（PAP），免疫反应部位呈黑点状；HE或甲苯胺蓝染色的半薄切片上，免疫反应部位呈棕黄色。取相连续的超薄切片为避免电镜铅、铀染色反应与免疫反应之间的混淆，分别以两个铜网捞取，其中之一进行染色观察，另一以铀单染色或不染色进行对照观察。包埋前染色法的优点是：①切片染色前不经固定、脱水及包埋等过程，不破坏抗原。②在免疫反应阳性部位定位作超薄切片，提高电镜下的检出率。适用含抗原量较少的组织。第10页，共45页，星期日，2025年，2月5日2包埋后染色（载网染色）组织标本经过固定、脱水及树脂包埋、制成超薄切片；免疫组化染色（载网染色）注意事项：①四氧化锇具有保存抗原的作用，但应用四氧化锇可使抗原活性明显减低。后固定中一般以不用四氧化锇为佳，或尽量缩短在四氧化锇中