核酸分子杂交技术.pptVIP

二、Northern印迹杂交1、基本原理和基本过程与Southernblot基本相同2、鉴别RNA3、探针可用DNA或RNA片段4、待测样品为总RNA或mRNA第30页，共50页，星期日，2025年，2月5日Northern印迹与Southern印迹的不同点1、变性：RNA电泳前加热变性、电泳时加变性剂保持RNA处于变性状态，DNA电泳前和电泳中不变性2、转膜：RNA转膜前不需变性和中和处理,Southern印迹时，DNA转膜前需进行碱变性及中和处理3、靶核酸为RNA第31页，共50页，星期日，2025年，2月5日三、斑点及狭缝印迹杂交1、斑点印迹为圆形2、狭缝印迹为线状3、鉴别DNA、RNA4、简单、快速，同一张膜可检测多个样品5、特异性不高、不能鉴别核酸分子量第32页，共50页，星期日，2025年，2月5日四、原位杂交1、定义：将标记的核酸探针与固定在细胞或组织中的核酸进行杂交，称原位杂交。根据检测物分细胞内原位杂交和组织切片内原位杂交；根据探针与待检核酸分：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA杂交第33页，共50页，星期日，2025年，2月5日保持组织细胞的形态对核酸无抽提，修饰与降解作用不改变核酸在组织细胞内的定位不阻碍核酸与探针的杂交过程对杂交信号无遮蔽作用理化性质稳定2、杂交过程：（1）组织或细胞的固定理想固定液应具备：第34页，共50页，星期日，2025年，2月5日（2）组织细胞杂交前的预处理去垢剂（如Tritonx-100和SDS）和蛋白酶K去除核酸表面的蛋白质组织细胞内的核酸与蛋白质结合成核酸蛋白复合体控制消化时间，避免细胞结构破坏和核酸从载玻片上脱落第35页，共50页，星期日，2025年，2月5日第1页，共50页，星期日，2025年，2月5日变性复性DNA-DNA杂交双链分子第2页，共50页，星期日，2025年，2月5日一、DNA变性与复性（一）DNA变性1、定义：某些理化因素导致两条DNA链间的氢链断裂变为单链的过程，称DNA变性第3页，共50页，星期日，2025年，2月5日2、变性的方法：（1）热变性：温度升高到90~100℃时，双链核酸分子链间的氢键完全断裂。（2）酸碱变性：pH值低于3或高于10时，双链核酸分子链间的氢键断裂。（3）化学试剂变性：如尿素、甲酰胺、甲醛等使双链核酸分子链间的氢键断裂。第4页，共50页，星期日，2025年，2月5日3、变性后的理化性质变化：粘度降低密度增加紫外吸收值增加第5页，共50页，星期日，2025年，2月5日4、DNA变性曲线AT区先解链GC区后解链阶梯式曲线第6页，共50页，星期日，2025年，2月5日5、GC含量与Tm值之间的关系（G+C）%=（Tm-69.3)×2.44Tm=(G+C)%×0.41+69.3第7页，共50页，星期日，2025年，2月5日（二）复性1、定义：变性的单链核酸分子在一定条件下按碱基互补原则重新结合为双链核酸的过程，称复性或杂交。具有互补序列的两条单链核酸都可互补形成双链：DNA/DNA、RNA/DNA、RNA/RNA、寡核苷酸/DNA和寡核苷酸/RNA。第8页，共50页，星期日，2025年，2月5日2、复性过程（1）单链分子间碰撞形成局部双链（2）局部双链周围的碱基如不配对时，双链重新解离（3）局部双链周围的碱基如配对，则形成中心序列（4）形成完整的双链分子第9页，共50页，星期日，2025年，2月5日3、复性的速率方程（服从二级反应动力学）dCdt=K2C2（1）将（1）积分CCo11+K2Cot=（2）一半单链DNA分子复性时，（2）式中的为121211+K2Cot=Cot1/2值越大，复性速度越慢CCo（3）1K2Co