第09章免疫标记技术.pptVIP

三、常用的免疫酶标记技术（一）免疫组织化学染色1标本制备与免疫荧光相同2标本处理用1%~3%的H2O2甲醇处理标本，低温条件下，作用10~15分钟，可同时起到固定和消除内源酶的作用。第30页，共55页，星期日，2025年，2月5日3封闭10%卵白蛋白（OVA）或0.05%Tween-80和含有1%牛血清白蛋白（BSA）的PBS对标本处理30min，能消除背景颜色。4染色方法可采用直接法、间接法等，与免疫荧光方法相似。第31页，共55页，星期日，2025年，2月5日（二）酶联免疫吸附实验Enzyme-linkedimmunosorbentassay(ELISA)将抗原或抗体吸附于固相载体，在载体上进行免疫酶反应，底物显色后用肉眼或分光光度计判定结果。1载体聚苯乙烯微量滴定板最常用，有96孔、40孔以及酶标条。第32页，共55页，星期日，2025年，2月5日2包被将抗原或抗体吸附于固相表面的过程。大多数抗原易吸附在表面。用碳酸盐缓冲液包被，4℃过夜或37℃吸附2~3h。3洗涤用含0.05%Tween-80的PBS第33页，共55页，星期日，2025年，2月5日4实验方法直接法用于测抗原（如沙门氏菌）（1）待检抗原包被（2）洗涤3~5次，每次3~5min（3）封闭含1%OVA的PBS（pH7.2，浓度为10mmol）（4）洗涤同上（5）加酶标记的抗沙门氏菌的单抗，置湿盒中，37℃作用1~2h（6）洗涤同上（7）加底物显色，测OD值第34页，共55页，星期日，2025年，2月5日间接法：用于测抗体（如测AIV抗体）（1）AIV病毒包被（2）洗涤3~5次，每次3~5min（3）封闭含1%OVA的PBS（pH7.2，浓度为10mmol）（4）洗涤同上（5）加待检抗体，置湿盒中，37℃作用1~2h（6）洗涤同上（7）加酶标记抗抗体，置湿盒中，37℃作用1~2h（8）加底物显色，测OD值第35页，共55页，星期日，2025年，2月5日夹心法（又称双抗体法，用于测抗原）（1）抗AIV多抗包被（2）洗涤3~5次，每次3~5min（3）封闭含1%OVA的PBS（pH7.2，浓度为10mmol）（4）洗涤同上（5）加待检抗原，置湿盒中，37℃作用1~2h（6）洗涤同上（7）加酶标记抗AIV单抗，置湿盒中，37℃作用1~2h（8）加底物显色，测OD值第36页，共55页，星期日，2025年，2月5日双抗体夹心法

（1）抗AIV多抗包被（2）洗涤3~5次，每次3~5min（3）封闭含1%OVA的PBS（pH7.2，浓度为10mmol）（4）洗涤同上（5）加待检抗原，置湿盒中，37℃作用1~2h第37页，共55页，星期日，2025年，2月5日（6）洗涤同上（7）加抗AIV单抗，置湿盒中，37℃作用1~2h（8）洗涤同上（9）加酶标记抗AIV单抗，置湿盒中，37℃作用1~2h（10）洗涤，加底物显色，测OD值第38页，共55页，星期日，2025年，2月5日结果判定：P/N≥2.1判为阳性实验中，要设置阳性对照、阴性对照、空白对照。实验时，先用空白对照孔调零。第39页，共55页，星期日，2025年，2月5日第1页，共55页，星期日，2025年，2月5日根据抗原抗体结合的特异性和标记分子的敏感性建立的技术，称免疫标记技术。(immunolabellingtechnique)第2页，共55页，星期日，2025年，2月5日高敏感性的标记分子主要有荧光素、酶、放射性同位素，由此建立了免疫荧光技术、免疫酶技术和放射免疫分析等技术。特点：敏感性高、特异性强应用：微生物鉴定、传染病诊断、生物活性物质的测定、基因表达产物的检测。第3页，共55页，星期日，2025年，2月5日第一节免疫荧光抗体技术Immunofluorescenceantibodytechnique指用荧光素对抗体进行标记，然后用荧光显微镜观察荧光，以分析示踪相应的抗原或抗体的方法。Coons等1941年建立该技术，当时用荧光黄标记，但效果不好，故不能推广。第4页，共55页，星期日，2025年，2月5日当发现异硫氰酸荧光素（FITC）被发现后，以及荧光抗体纯化技术的发展，显著提高了荧光抗体技术的敏