第三章高效液相色谱.pptVIP

第62页，共105页，星期日，2025年，2月5日HPLC分析方法建立的一般过程HPLC定性、定量分析HPLC基本实验技术第63页，共105页，星期日，2025年，2月5日第64页，共105页，星期日，2025年，2月5日首先要查文献资料,包括仪器厂商的应用资料,了解他人的工作,找出你需要的参考条件。若手头没有合适的参考资料,则可根据分子分子量大小、在水中和有机溶剂中的溶解度、化学结构、极性和稳定性等物理化学性质确定分离模式,选择主要的色谱条件：色谱柱、流动相组成和检测器类型。评价液相色谱柱系统选择的二个标准：???①有满意的分离度??②有合适的保留值范围。第65页，共105页，星期日，2025年，2月5日定性分析利用保留值定性对照保留值：在确定的色谱条件下(色谱柱、流动相组成、柱温等),对照被测化合物与标准样的保留时间。标准加入：对照样品和加标样品的峰高变化确定被测化合物的色谱峰位置利用检测器的选择性定性（联用技术）

采用全波长扫描吸收检测器：对照被测化合物与标准物的保留值和光谱图。

采用质谱检测器：对照被测化合物与标准物的保留值和质谱图。离线结构分析：收集柱后流出的纯组分，进行结构分析

第66页，共105页，星期日，2025年，2月5日第67页，共105页，星期日，2025年，2月5日第68页，共105页，星期日，2025年，2月5日第69页，共105页，星期日，2025年，2月5日第70页，共105页，星期日，2025年，2月5日第71页，共105页，星期日，2025年，2月5日第72页，共105页，星期日，2025年，2月5日第73页，共105页，星期日，2025年，2月5日第74页，共105页，星期日，2025年，2月5日（动画2）第30页，共105页，星期日，2025年，2月5日自动进样装置第31页，共105页，星期日，2025年，2月5日分离系统：色谱柱包括柱管与固定相两部分。柱管材料有玻璃、不锈钢、铝、铜及内衬光滑的聚合材料的其他金属。一般色谱柱长5～30cm，内径为4～5mm，凝胶色谱柱内径3～12mm，制备柱内径较大，可达25mm以上。操作注意：流动相的转换流速的变化幅度温度变化幅度专用色谱柱：样品及溶剂的要求有机——有机溶剂：直接转换有机——缓冲溶液：用纯水过渡记住：拿到一根新柱一定要先看使用说明第32页，共105页，星期日，2025年，2月5日检测器：利用被测物的某一物理或化学性质与流动相有差异的原理，当被测物从色谱柱上流出时，会导致流动相背景值发生变化，从而在色谱图上以色谱峰形式表现出来。几种主要检测器的基本特性第33页，共105页，星期日，2025年，2月5日紫外吸收检测器（UV-VIS）

具有灵敏度高，线性范围宽，对流动相基本无响应，对流速和温度不敏感等特点，它是液相色谱最常用的检测器。固定波长型：光源波长固定，一般为254nm，简单、灵敏。可变波长型：常规氘灯（紫外光源）的使用范围195～400nm扫描型或二极管阵列：可以瞬间实现紫外可见光区的全波长扫描，得到时间－波长－吸收强度三维色谱图。样品池第34页，共105页，星期日，2025年，2月5日紫外光度检测器光路图：（动画3）第35页，共105页，星期日，2025年，2月5日紫外检测的主要参数是选择检测波长应考虑溶质和流动相的吸收特性：常选择被测物质能产生最大吸收的波长作检测波长，但为了选择性或其他目的也可适当牺牲灵敏度而选择吸收稍弱的波长；应尽可能选择检测波长下没有背景吸收的流动相第36页，共105页，星期日，2025年，2月5日光电二极管阵列检测器紫外检测器的重要进展；光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。第37页，共105页，星期日，2025年，2月5日第38页，共105页，星期日，2025年，2月5日示差折光检测器（refractiveindex，RX）除紫外检测器之外应用最多的检测器。通过连续监测参比池和测量池中溶液的折射率之差来测定溶质浓度。折射率是物质的通用性质，示差折射检测器是一种通用型的整体性质检测器折射率对温度的变化非常灵敏，检测器必须恒温灵敏度较低，不能用于梯度洗脱。第39页，共105页，星期日，2025年，2月5日第40页，共105页，星期日，2025年，2月5日荧光检测器（fluorescencedetector，FLD）它用于检测物质本身具有荧光或为了提高灵敏度将无荧光的物质衍生成荧光体。可用荧光检测