高考总复习生物学62选择性必修3素养加强课10PCR技术与电泳相关问题114.pdfVIP

提升点1PCR技术及应用

1．PCR循环图示及规律

2．PCR中的数量关系

循环次数123n

DNA分子数2482n

含引物1(或2)的DNA

n

1372－1

分子数

同时含引物1、2的DNA

123n

0＝2－22＝2－26＝2－22－2

分子数

共消耗的引物数量2＝21＋1－26＝22＋1－214＝23＋1－22n＋1－2

3．利用RT-PCR技术进行RNA病毒的核酸检

(1)RT-PCR技术(逆转录荧光PCR技术)

①先从样本中提取RNA，RNA中可能有某病毒RNA，同时也存在很多采样患

者的组织和存在于采样部位的微生物RNA。

②先通过逆转录酶将样本RNA逆转录为cDNA。因为某病毒中的核酸为

RNA，而RNA极易降解，为了防止检测的物质在检测过程中降解，把它转换为

更稳定DNA。

③检测扩增出PCR产物，即DNA片段。扩增的病毒DNA片段能够发出荧光

而被仪器检测到。这些扩增出的供检测的产物的多少，很大程度上取决于样本中

目标RNA量的多少。而目标RNA量的多少又与样本中病毒的多少相关。

(2)荧光探针法(TaqMan技术)是临床检测中最常用的检测方法。PCR扩增时，加

入一对引物的同时再加入一个特异性的荧光探针。该探针是一个寡核苷酸，5′

端标记一个荧光报告基团(Reporter，R)，3′端标记一个淬灭基团(Quencher，

Q)。当探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，以至于无法检测

到荧光信号；而当PCR扩增时(在延伸阶段)，探针会被Taq酶5′→3′外切

酶活性酶切降解，使报告基团和淬灭基团分离，报告基团发射底的荧光不会再被

吸收，从而可以在荧光监测系统接收到荧光信号，即每扩增一条DNA，就形成

一个荧光分子，PCR产物的形成与荧光分子的形成完全同步，PCR产物越多，

荧光信号累积的越多，荧光强度越大。如图所示：

荧光定量PCR仪能够监测出荧光到达预先设定阈值的循环数(Ct值)与病毒核酸

浓度有关，病毒核酸浓度越高，Ct值越小。Ct40或无Ct值判定为阴性。

通过设计引物，运用PCR技术可以实现目的基因的定点诱变。下图为基因工程

中获取突变基因的过程，其中引物1序列中含有一个碱基T不能与目的基因片段

配对，但不影响引物与模板链的整体配对，反应体系中引物1和引物25′端

分别设计增加限制酶a和限制酶b的识别位点。下列有关叙述正确的是()

A．在PCR反应体系中还需要加入4种游离脱氧核苷酸、解旋酶、Taq酶等

B．第3轮PCR结束后，含突变碱基对且两条链等长DNA占1/2

C．引物中设计两种限制酶识别位点有利于目的基因定向插入载体

D．第2轮PCR，引物1能与图中②结合并且形成两条链等长的突变基因

C[PCR反应体系通过高温使DNA解旋(变性)，不需要加入解旋酶，A错误；

第3轮PCR结束后，含突变碱基对且两条链等长的DNA有2个，而总D