核酸提取及常见问题分析.pptVIP

*******************************材料准备细胞裂解核酸分离纯化核酸沉淀核酸溶解保存DNA提取基本步骤第29页，共60页，星期日，2025年，2月5日基因组DNA新鲜材料，低温保存血液基因组DNA提取选择有核细胞细胞培养时间不能过长含病毒的液体材料提取前先富集质粒DNA对数期的菌体培养时应加入筛选压力低拷贝或大质粒，应加大菌体用量菌株不要频繁转接（质粒丢失）材料准备细胞裂解核酸分离纯化核酸沉淀核酸溶解保存DNA提取基本步骤第30页，共60页，星期日，2025年，2月5日基因组DNA材料过多影响裂解，导致DNA量少，纯度低针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：植物材料－－液氮研磨动物组织－－匀浆或液氮研磨组培细胞－－蛋白酶K细菌－－溶菌酶破壁酵母－－破壁酶或玻璃珠质粒DNA菌体量适当，除净培养基变性的时间不要过长（5分钟）控制复性时间，避免基因组DNA的污染G＋菌、酵母细胞酶或机械处理材料准备细胞裂解核酸分离纯化核酸沉淀核酸溶解保存DNA提取基本步骤第31页，共60页，星期日，2025年，2月5日采用吸附材料吸附分离DNA，应提供相应的缓冲体系采用有机溶剂（酚/氯仿）抽提时应充分而轻柔的混匀离心分离两相时，应保证一定的转速和时间针对不同材料的特点，在提取过程中辅以相应的去杂质的方法材料准备细胞裂解核酸分离纯化核酸沉淀核酸溶解保存DNA提取基本步骤第32页，共60页，星期日，2025年，2月5日蛋白质的去除：酚/氯仿抽提使用变性剂（SDS、异硫氰酸胍等）蛋白酶处理材料准备细胞裂解核酸分离纯化核酸沉淀核酸溶解保存DNA提取基本步骤第33页，共60页，星期日，2025年，2月5日多糖的去除：多糖水解酶在提取缓冲液中加1/2体积氯苯，氯苯可以与多糖的羟基作用，从而去除多糖。用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500μLDNA液中加入200μl20%PEG8000(含1.2MNaCl)，冰浴20min。材料准备细胞裂解核酸分离纯化核酸沉淀核酸溶解保存DNA提取基本步骤第34页，共60页，星期日，2025年，2月5日多酚的去除：加入还原剂：β-巯基乙醇、抗坏血酸、半胱氨酸、二硫苏糖醇等加入易与酚类结合的试剂：如PVP、PEG，可防止酚类与DNA的结合盐离子的去除：70％的乙醇洗涤材料准备细胞裂解核酸分离纯化核酸沉淀核酸溶解保存DNA提取基本步骤第35页，共60页，星期日，2025年，2月5日预冷的乙醇或异丙醇更充分沉淀加入1/10体积的NaAc（pH5.2，3M）更充分沉淀晾干DNA，让乙醇充分挥发材料准备细胞裂解核酸分离纯化核酸沉淀核酸溶解保存若长期储存建议使用TE缓冲液溶解pH值为8.0，可防止DNA发生酸解DNA提取基本步骤第36页，共60页，星期日，2025年，2月5日问题一：DNA降解材料不新鲜、反复冻融或细胞衰老提取操作过于剧烈，DNA被打断外源核酸酶污染低温保存，避免反复冻融液氮研磨或匀浆组织，应在解冻前加入裂解缓冲液增加裂解液中螯合剂的含量细胞裂解后操作应尽量轻柔试剂用无菌水配制，耗材经高温灭菌DNA分装保存于缓冲液，避免反复冻融第37页，共60页，星期日，2025年，2月5日问题二：DNA样品不纯DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质DNA在溶解前，有酒精残留，酒精抑制后续酶解反应DNA中残留有金属离子重新纯化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等杂质（具体方法见前）重新沉淀DNA，让酒精充分挥发增加70％乙醇洗涤的次数（2-3次）第38页，共60页，星期日，2025年，2月5日实验材料不佳或量少破壁或裂解不充分沉淀不完全洗涤时DNA丢失尽量选用新鲜（幼嫩）的材料动植物要匀浆研磨充分；G＋菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁高温裂解时，时间适当延长（对于动物细胞、细菌可增加PK的用量）低温沉淀，延长沉淀时间加辅助物，促进沉淀洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒问题三：DNA提取量少第39页，共60页，星期日，2025年，2月5日RNA提取

及常见问题分析TIANGENBIOTECH(BEIJING)CO.,LTD.第40页，共60页