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（7）组氨酸在各种氨基酸中，组氨酸的性质比较独特：具有弱疏水性、咪唑环为弱电性。因此组氨酸可与蛋白质发生亲和结合作用。虽然这种亲和作用的机理尚不十分清楚，但利用固定化组氨酸吸附蛋白质以及吸附蛋白的洗脱实验结果表明，静电和疏水性相互作用均有可能参与亲和结合。在盐浓度较低和pH约等于目标蛋白质等电点的溶液中，固定化组氨酸的亲和吸附作用最强，随着盐浓度增大，亲和吸附作用降低。因此利用组氨酸为配基可亲和分离等电点相差较大的蛋白质，洗脱则可采用增大盐浓度的梯度洗脱法。第30页，共69页，星期日，2025年，2月5日（8）肝素肝素（heparin）是存在于哺乳动物的肝、肺、肠等脏器中的酸性多糖类物质，分子量一般为5～30KD，具有抗凝血作用。肝素与脂蛋白、脂肪酶、甾体受体、限制性核酸内切酶、抗凝血酶、凝血蛋白质等具有亲和作用，可用作这些物质的亲和配基。肝素的亲和结合作用在中性pH和低浓度盐溶液中较强，随着盐浓度的增大结合作用降低第31页，共69页，星期日，2025年，2月5日活化基质的活化是指通过对基质进行一定的化学处理，使基质表面上的一些化学基团转变为易于和特定配体结合的活性基团。溴化氰活化法溴化氰活化法是最常用的活化方法之一，活化过程主要是生成亚胺碳酸活性基团，它可以和伯氨(NH2)反应，主要生成异脲衍生物。反应如下：

介质活化与耦联第32页，共69页，星期日，2025年，2月5日活化耦联过程20ml、2mol/L碳酸氢钠+20g湿琼脂糖，冰浴4-5min搅拌过程中加入溴化氰，4-5℃10min过滤，冷蒸馏水和缓冲液洗涤加入溶于缓冲液中的配基，搅拌2h，4℃保存第33页，共69页，星期日，2025年，2月5日这种方法的缺点是溴化氰活化法的基质和配体偶联后生成的异脲衍生物中氨基的pKa＝10.4，所以通常会带一定的正电荷，从而使基质可能有阴离子离子交换作用，增大了非特异性吸附，影响亲和层析的分辨率。另外溴化氰活化的基质与配体结合不够稳定，尤其是当与小配体结合时，可能会出现配体脱落现象。另外溴化氰有剧毒、易挥发，所以操作不便。

第34页，共69页，星期日，2025年，2月5日环氧基活化法在热的浓碱溶液中，多糖类化合物与环氧氯丙烷作用生成环氧化合物；在碱性条件下，其环氧化合物又能与氨基酸或蛋白质上氨基偶联。第35页，共69页，星期日，2025年，2月5日这种活化方法的优点是活化后不引入电荷基团，而且基质与配体形成的N－C、O－C和S－C键都很稳定，所以配体与基质结合紧密，亲和吸附剂使用寿命长，而且便于在亲和层析中使用较强烈的洗脱手段，另外这种处理方法没有溴化氰的毒性。它的缺点是用环氧氯丙烷活化的基质在与配体偶联时需要碱性条件，pH为9-13，温度为20-40℃。这样的条件对于一些比较敏感的配体可能不适用。上面两种方法是比较常用的方法。另外还有甲苯磺酰氯法、双功能试剂法。第36页，共69页，星期日，2025年，2月5日亲和配基耦联密度测定耦联密度决定了介质的吸附容量分光光度法量差法分析水解作用分析元素分析法第37页，共69页，星期日，2025年，2月5日间臂分子当配基的分子量较小时，将其直接固定在载体上，会由于载体的空间位阻，配基与生物大分子不能发生有效的亲和吸附作用。如果在配基与载体之间连接间隔臂，可以增大配基与载体之间的距离，使其与生物大分子发生有效的亲和结合。第38页，共69页，星期日，2025年，2月5日加入间臂的长度要恰当，太短则效果不明显；太长则容易由疏水性非特异吸附造成弯曲，反而降低吸附效率。间臂的疏水性也需要考虑，应尽量减小对配基的影响。如间臂和配基疏水性较强，则效果不明显。第39页，共69页，星期日，2025年，2月5日第40页，共69页，星期日，2025年，2月5日常见的亲和色谱核苷酸及辅酶亲和色谱固定化金属离子亲和色谱染料亲和色谱免疫亲和色谱基团专一性大分子亲和色谱第41页，共69页，星期日，2025年，2月5日核苷酸及辅酶亲和色谱指将核苷酸（或辅酶）作为亲和配基固定在色谱介质上进行亲和色谱的技术，主要利用核苷酸特别是辅酶因子和蛋白质之间的专一性识别达到分离纯化目的第42页，共69页，星期日，2025年，2月5日第43页，共69页，星期日，2025年，2月5日介质制备碳二亚胺直接法偶联溴化氢活化琼脂糖→连接氨基己酸→加入核苷酸→溶液中保存→洗涤→偶联