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肠道病毒柯萨奇B5型巢式RT-PCR检测方法：构建与效能评估

一、引言

1.1研究背景与意义

肠道病毒柯萨奇B5型（CoxsackievirusB5，CVB5）作为肠道病毒属的重要成员，是一种单股正链RNA病毒，在全球范围内广泛传播，严重威胁人类健康。CVB5感染人体后，临床表现复杂多样。轻症患者可能仅出现上呼吸道感染、腹泻及手足口病（HFMD）等症状，这些轻症疾病虽然通常具有自限性，但在儿童群体中传播迅速，易造成局部小规模流行，给家庭和社会带来一定的经济负担和心理压力。比如在幼儿园等儿童聚集场所，一旦有儿童感染CVB5引发手足口病，短时间内就可能导致多名儿童被传染，幼儿园不得不采取停课等措施来控制疫情扩散。

而重症患者则可能引发病毒性脑炎、无菌性脑膜炎、胰腺炎、弛缓性麻痹、扩张性心肌炎及糖尿病等严重疾病。其中，无菌性脑膜炎及病毒性脑炎呈全球范围分布，发病年龄主要集中于18岁以下的青少年人群，多发于夏秋季节。病毒性脑炎会影响大脑功能，导致患者出现发热、头痛、抽搐、意识障碍和脑膜刺激征等症状，即使经过治疗，也可能给患者留下不同程度的神经系统后遗症，如智力发育迟缓、癫痫等，严重影响患者的生活质量和未来发展。扩张性心肌炎会损害心脏功能，导致心脏扩大、心力衰竭，甚至危及生命。有研究表明，CVB5感染还是导致胰岛素依赖型（Ⅰ型）糖尿病的主要诱发因素之一，这不仅给患者带来长期的疾病困扰，还会增加社会医疗资源的消耗。

目前，鉴定CVB5的主要方法和金标准是病原的分离培养与PCR扩增测序，但这种方法存在诸多局限性。病原分离培养需要特定的细胞系和培养条件，操作繁琐，耗费时间长，通常需要数天至数周才能得到结果，且检出率低。在实际临床检测中，由于病毒在样本中的含量可能较低，或者受到样本采集、运输和保存等因素的影响，导致病原分离培养的成功率不高。PCR扩增测序虽然准确性高，但同样耗时费力，费用高昂，对实验设备和技术人员的要求也很高，这使得该方法在基层医疗机构和大规模流行病学调查中难以推广应用。

因此，开发一种快速、准确、灵敏且操作简便的检测方法对于CVB5的防控至关重要。巢式RT-PCR技术作为一种高效的分子生物学检测技术，具有较高的特异性和灵敏度。该技术通过两轮PCR扩增，先用一对外层引物进行第一轮扩增，再以第一轮扩增产物为模板，用另一对内层引物进行第二轮扩增，能够极大地提高目标基因的扩增效率和特异性，有效减少假阳性结果。即使样本中病毒含量极低，巢式RT-PCR技术也有可能检测到病毒的存在。将巢式RT-PCR技术应用于CVB5的检测，有望克服传统检测方法的不足，为临床诊断、疫情监测和流行病学调查提供有力的技术支持，从而及时采取有效的防控措施，降低CVB5感染的发生率和危害程度。

1.2国内外研究现状

在国外，对于肠道病毒的检测技术研究起步较早，发展较为成熟。传统的病毒检测方法如细胞培养法和血清学检测法，在早期的病毒检测中发挥了重要作用。细胞培养法能够准确分离出病毒，但操作繁琐、耗时久，对实验条件要求苛刻，且病毒培养的成功率受多种因素影响，限制了其在临床快速诊断中的应用。血清学检测法通过检测病毒抗体来判断感染情况，然而存在窗口期，在感染早期可能出现假阴性结果，且无法区分近期感染和既往感染。

随着分子生物学技术的飞速发展，PCR技术逐渐成为病毒检测的重要手段。常规PCR技术具有快速、灵敏的特点，但对于一些低拷贝数的病毒样本，检测灵敏度有限，容易出现假阴性结果。为了提高检测的灵敏度和特异性，巢式RT-PCR技术应运而生。国外学者在巢式RT-PCR技术的应用方面进行了大量研究，将其应用于多种病毒的检测，包括肠道病毒。有研究针对肠道病毒通用引物进行设计，通过巢式RT-PCR技术成功检测出多种肠道病毒，为肠道病毒感染的诊断提供了更有效的方法。但针对CVB5型病毒的特异性巢式RT-PCR检测方法的研究相对较少，已有的研究在引物设计、反应条件优化等方面存在差异，导致检测的灵敏度和特异性参差不齐。

在国内，肠道病毒检测技术的研究也在不断深入。传统检测方法在基层医疗机构仍有一定应用，但随着对病毒检测准确性和时效性要求的提高，分子生物学检测技术得到了更广泛的推广。国内学者在巢式RT-PCR技术检测肠道病毒方面也取得了一定成果。有研究从GenBank下载河南分离株CVB5全基因序列，利用相关软件进行同源性比较，在同源性较高的区域设计巢式PCR引物，经过一系列优化和验证，建立了针对CVB5的巢式RT-PCR检测方法，该方法在灵敏度和特异性方面表现良好。然而，目前国内的研究主要集中在个别地区的病毒株，对于不同地区、不同流行株的检测效果