抗体的检测和纯化 (2).pptVIP

特异杂质含量验证DNA含量：DNA分子杂交法测定。（100pg/一剂量）热原（内毒素）：家兔法等试剂。（5EU/Kg）病毒含量：Scale-down。（工艺除病毒能力需达到10log以上）第28页，共74页，星期日，2025年，2月5日单克隆抗体的浓缩目的方法：冻融浓缩法原理：冻融处理后的样品，其溶质集中在浓缩管的下端，越近管底浓度越高第29页，共74页，星期日，2025年，2月5日ELISA------徐顺胡坚李静一第30页，共74页，星期日，2025年，2月5日1.ELISA的原理2.ELISA的类型3.试剂准备：免疫吸附剂结合物酶底物的准备4.对照设定5.标本的采取和保存6.结果判断第31页，共74页，星期日，2025年，2月5日ELISA（Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay)是一种免疫测定试验。 基础:抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。加入酶反应的底物后，底物被酶催化成为有色产物，产物的量与标本中受检物质的量直接相关，由此进行定性或定量分析。1.ELISA的原理第32页，共74页，星期日，2025年，2月5日酶免疫测定类型这种固相酶免疫测定方法在1971年最初建立时称为酶联免疫吸附剂测定，简称ELISA。酶免疫技术酶免疫组化酶免疫测定均相酶免疫测定非均相酶免疫测定固相酶免疫测定液相酶免疫测定第33页，共74页，星期日，2025年，2月5日1.1抗原抗体反应1.1.1可逆性抗原与抗体结合形成抗原抗体复合物的过程是一种动态平衡，其反应式为：Ag+Ab→Ag·Ab抗体的亲和力（affinity），可以用平衡常数K表示：K=[Ag·Ab]／[Ag][Ab],Ag·Ab的解离程度与K值有关。高亲和力抗体的抗原结合点与抗原的决定簇在空间构型上非常适合，两者结合牢固，不易解离。解离后的抗原或抗体均能保持原有的结构和活性。第34页，共74页，星期日，2025年，2月5日1.1.2特异性抗原抗体的结合发生在抗原的决定簇与抗体的结合位点之间。化学结构和空间构型互补关系，具有高度的特异性。测定某一特定的物质，而不需先分离待检物。

第35页，共74页，星期日，2025年，2月5日1.1.3最适比例第36页，共74页，星期日，2025年，2月5日1.1.4敏感性化学比色法的敏感度为mg/ml水平酶反应测定法的敏感度约为5-10μg/ml免疫测定中凝胶扩散法和浊度法的敏感度与酶反应法相仿标记的免疫敏感度可提高数千倍，达ng/ml水平例如，HBsAg，其敏感度可达0.1ng/ml。第37页，共74页，星期日，2025年，2月5日2.1双抗原夹心法测抗体用特异性抗原进行包被和制备酶结合物。此法中受检标本不需稀释，可直接用于测定，因此其敏感度相对高于间接法。乙肝标志物中抗HBsAg的检测常采用本法。本法关键在于酶标抗原的制备，应根据抗原结构的不同，寻找合适的标记方法。2ELISA的类型第38页，共74页，星期日，2025年，2月5日2.2间接法测抗体传染病的诊断。间接法的优点是只要变换包被抗原就可利用同一酶标抗抗体建立检测相应抗体的方法。第39页，共74页，星期日，2025年，2月5日2.3竞争法测抗体当抗原材料中的干扰物质不易除去，或不易得到足够的纯化抗原时，可用此法检测特异性抗体。第40页，共74页，星期日，2025年，2月5日2.4捕获包被法测抗体IgM的检测常用于传染病的诊断。用抗人IgM抗体包被固相，以捕获血清标本中的IgM（其中包括针对抗原的特异性IgM抗体和非特异性的IgM）。此法常用于病毒性感染的早期诊断。第41页，共74页，星期日，2025年，2月5日3.ELISA的试剂(A、B、C三部分)ELISA中有三个必要的试剂：免疫吸附剂、结合物和酶的底物。（1）已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）；（2）酶标记的抗原或抗体（结合物）；（3）酶的底物；（4）阴性对照品和阳性对照品，参考标准品；（5）结合物及标本的稀释液；（6）洗涤液；（7）酶反应终止液第42页，共74页，星期日，2025年，2月5日ELISA的试剂准备A固相载体聚苯乙烯具有较强的吸附蛋白质的性能，抗体或蛋白质抗原吸附其上后仍保留原来的免疫学活性。聚氯乙烯。聚氯乙烯对蛋白质的吸附性能比聚苯乙烯高，但空白值也略高。良好的E