细胞工程第三细胞培养的基本方法.pptVIP

1污染及途径：细胞培养中，与培养无关的杂质的混入培养系统统称为污染。◆空气：最主要途径，消毒不严格，季节、净化工作台故障、湿度、温度、周边环境等。◆器材清洗消毒不彻底◆操作：基本功不扎实、不认真、不规范、交叉污染、器具消毒不严格等。◆血清：制备水平低，支原体或病毒污染。◆组织样本四、细胞培养的污染和检测第31页，共42页，星期日，2025年，2月5日最严峻的挑战-污染(contamination)细胞培养的污染问题十分重要，一旦发生污染，将导致前功尽弃。所以细胞培养一定要建立无菌观念。遇到培养污染要分析原因，及时处理。培养细胞一旦发生污染多数将无法挽回，加入抗生素也基本无能为力。特别是霉菌和细菌。第32页，共42页，星期日，2025年，2月5日1.细胞培养中常见的污染物有细菌、酵母菌、真菌、支原体和病毒等。在出现以下情况时培养的细胞可能有污染：a.培养液的酸碱度发生异常的改变。b.培养液出现混浊。c.光镜观察到菌丝和颗粒。d.细胞出现死亡或增殖缓慢等2.常见污染及判断第33页，共42页，星期日，2025年，2月5日2.细菌污染：常见革兰氏阴性菌（白色葡萄球菌）、大肠杆菌、假单胞菌。现象：初期变化不明显，后期培养液浑浊，镜下可见菌体。预防：青霉素和链霉素可预防。第34页，共42页，星期日，2025年，2月5日3.真菌污染：常见烟曲霉、黑曲霉、毛霉菌、孢子霉、白念珠菌、酵母菌等。特点：大多呈白色或浅黄色小点漂浮于培养液表面；镜下呈丝状、管状或树枝状，纵横交错，散在细胞周边和细胞之间。抗真菌制剂可预防和排除真菌污染。第35页，共42页，星期日，2025年，2月5日4.支原体污染：介于细菌和病毒之间，能独立生活的最小微生物。最常见、不易察觉；大小介于0.2-2μm，约1%可通过滤菌器对酸耐受性差，对热较敏感，青霉素无效。“正常”感觉。支原体污染细胞后，能抑制细胞代谢和生长，改变核酸合成，影响细胞的抗原性，引起细胞染色体改变，干扰DNA的复制，以及具有类病毒作用。在培养细胞初期，由于支原体对细胞的繁殖影响较小而往往被忽略。第36页，共42页，星期日，2025年，2月5日第1页，共42页，星期日，2025年，2月5日一、无菌操作技术1.实验器具和材料的准备根据使用器材不同选择正确合适的方法进行消毒和灭菌。2.培养室和超净台的消毒地面：0.1%新洁尔灭或2--5%来苏尔灭菌，紫外线照射30-50min；超净工作台及器具：每次实验前95%酒精擦拭消毒，紫外线照射消毒。3.洗手和着装：口罩、无菌服、帽子紫外线照射消毒；手部消毒。第2页，共42页，星期日，2025年，2月5日4.无菌培养操作：无菌操作技术要领点燃酒精灯：加热消毒。动作准确敏捷：不应太快。不用手触及已消毒物品操作面布局合理操作保持一定顺序培养用瓶和吸管的放置防止各种用液的交叉污染不向操作者讲话或咳嗽维护各种设备，保持良好工作状态。第3页，共42页，星期日，2025年，2月5日超净台内培养用品布局第4页，共42页，星期日，2025年，2月5日第5页，共42页，星期日，2025年，2月5日二、培养细胞的观察（一）相差显微镜观察1.原理：利用光在通过不同密度物质时的折射率和物体厚度差别，由于折射光程不同产生衍射而引起的光程变化。光程的变化引起相位差变化来观察物体结构。一般情况下人眼不能分辨相差，而相差显微镜利用光的衍射和干涉现象，把相差变为振幅差及明暗之差，就可以分辨出被检物体的结构。第6页，共42页，星期日，2025年，2月5日2.生长良好的细胞的镜下状态：A.在显微镜下可观察到细胞透明度大，折光性强，轮廓清。相差显微镜观察时可见细胞部分细微结构。B.若细胞生长状态不良，可见细胞轮廓增强，细胞折光性变弱，胞质中出现空泡、脂滴和其他颗粒状物质，细胞之间空隙增大，细胞形态不规则，甚至失去原有细胞的特点，产生圆缩脱落，有时细胞表面及周围出现丝絮状物。发现这种情况应及时处理。第7页，共42页，星期日，2025年，2月5日（二）倒置显微镜1.光源和聚光器位于载物台上方。2.物镜位于载物台下方。3.载物台上可放置培养皿，便于观察贴服于底壁上的活细胞。4.倒置显微镜可装配各种辅助设备：相差长焦距聚光器、暗视野聚光器、荧光显微镜光源、恒温调节器、照相机、摄影机等。5.可根据不同观察目的选用不同的相差物镜：正反差物镜、PL物镜、PLL物镜、NH物镜。第8页，共42页