第五章质谱法测定分子结构二大分子.ppt

蛋白质的二维分离第63页，共96页，星期日，2025年，2月5日 仪器 鉴定率肽质量指纹谱 MALDI ~50%(PeptideMassFingerprinter,PMF)多肽序列标签 LC/MS/MS ~80%(PeptideSequenceTag,PST)从新测序 LC/MS/MS 80%(DeNovo)蛋白质及混合物的定量分析：同位素编码亲和标记(Isotope-CodedAffinityTags,ICAT)蛋白质序列研究的三个层次第64页，共96页，星期日，2025年，2月5日蛋白质组研究技术路线样品(组织、细胞等)凝胶图象分析蛋白质鉴定二维数据库酶解HPLC-MS、MS/MS数据库检索二维凝胶电泳酶解肽混合物MS、MS/MS肽指纹谱肽序列标签从新测序第65页，共96页，星期日，2025年，2月5日一、肽质量指纹谱(PeptideMassFingerprinter,PMF)PMF测定速度快。PMF灵敏。PMF需要完整和准确的蛋白质序列数据库。第66页，共96页，星期日，2025年，2月5日分离的酶解的蛋白质96/384位样品靶数据处理和数据库检索质谱样品的准备MALDI质谱分析蛋白质一级结构结果PMF方法的一般流程第67页，共96页，星期日，2025年，2月5日洗胶/去污脱水减少S-S键洗涤/脱水1、In-gel酶切/消化Multiprobe(4x96WellPlat)样品体积0.5-100?L板上加热和冷却消化板加热37oC肽存储在-4oC冷却板酶试剂存储在-4oC冷却板修正-SH基加入trypsin溶液5-12小时肽提取2、质谱分析样品的制备灵敏度：500fmolesBSAin-gel。移液和消化时间8小时(1x96wellplat)。最多可进行4x96wellplat的同时消化。基本能力第68页，共96页，星期日，2025年，2月5日三、远电荷碎裂反应(Charge-RemoteFragmentation)远电荷碎裂：断裂发生在远离电荷的位置，与质谱解析一章中裂解均与电荷或自由基有关不同。主要原因是这种远电荷碎裂反应发生在具有较长的碳链化合物中，如长链脂肪酸、胆汁酸、类固醇等。远电荷碎裂反应在蛋白质分析中有时也会发生。研究方法：高能、中能、低能碰撞诱导解离MS/MS质谱。高能碰撞：2~10kV，磁质谱仪上，TOF/TOF等。低能碰撞:100V以内，四极杆质谱仪，离子阱质谱仪。中能碰撞：100~1000V，扇形电场磁场/TOF联用质谱(特制质谱)。第31页，共96页，星期日，2025年，2月5日1、远电荷碎裂的主要反应机理长链饱和化合物1,4氢消除反应(1)两步均裂反应(2)产生荷基异位离子末端不饱和离子长链不饱和化合物(a)近烯丙基键，记作Ap断裂，Proximalallylbond。远烯丙基-乙烯基键distalallyl–vinylbond,Avd近烯丙基-乙烯基键，记作Avp断裂，proximalallyl–vinylbond。X=O+或OLi2+。第32页，共96页，星期日，2025年，2月5日13-羰基-十八烷酸，12-羰基-十八烷酸的远电荷碎裂谱图第33页，共96页，星期日，2025年，2月5日十八烷酸CID-MIKES谱图，[M-Ht2Li]+(A)4,7-二烯十八烷酸,m/z293(B)6,9-二烯十八烷酸m/z293高能碰撞,6kV给出较多的信息，常用的远电荷碎裂的方法。第34页，共96页，星期日，2025年，2月5日长链脂肪酸[M-H]+离子的ES-MS/MS谱图(a)硬脂酸，m/z283;(b)油酸,m/z281;(c)亚油酸,m/z279.谱图采自于AutoSpec-OATOF仪器。碰撞能量400eV，Xe用作碰撞气体。中能碰撞，400eV特殊设计的仪器上实现，有较多的信息。第35页，共96页，星期日，2025年，2月5日低能CID谱，[M-Ht2Li]+，(4,