《体外皮肤变态反应ARE-Nrf2荧光素酶LuSens试验方法（征求意见稿）》及起草说明.docxVIP

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附件7

体外皮肤变态反应ARE-Nrf2荧光素酶LuSens试验方法

（征求意见稿）

TheARE-Nrf2LuciferaseLuSensTest

1范围

本方法规定了体外皮肤变态反应ARE-Nrf2荧光素酶LuSens试验的基本原则、要求和方法。

本方法适用于化妆品用化学原料潜在致敏性的评价。

2试验目的

本试验用于检测体外培养的LuSens细胞荧光素酶的表达变化，以评价受试物引起皮肤变态反应的可能性。

3定义

3.175%细胞存活率浓度值75%Cellviability（CV75）

受试物染毒后，细胞存活率为75%时对应的受试物浓度值。

3.2抗氧化反应元件Antioxidantresponseelement（ARE）

指存在于细胞保护基因的启动子区域，能够响应氧化应激并调控相关基因表达的作用元件。

3.3荧光素酶活性诱导倍数Foldluciferaseactivityinduction（Foldinduction）

扣除空白对照后，受试物和溶剂对照的细胞发光比值。

4试验的基本原则

当致敏物质接触皮肤后，角质形成细胞被激活，诱导炎症反应及特定细胞信号通路相关基因的表达。体外培养含有荧光素酶报告基因的人角质形成细胞系（LuSens细胞），暴露于受试物，通过计算细胞相对存活率和荧光素酶活性，从而预测受试物是否具有皮肤致敏性。

5试剂和材料

5.1细胞

选用含有ARE荧光素酶报告基因的人角质形成细胞株（LuSens细胞株）。

5.2培养基

细胞培养液1（MediumNo.1）：DMEM培养液中加入10%胎牛血清，1%抗生素，0.005%的嘌呤霉素盐酸盐。

细胞培养液2（MediumNo.2）：DMEM培养液中加入10%胎牛血清。

细胞培养液3（MediumNo.3）：DMEM培养液中加入1%胎牛血清。

5.3MTT检测液

储存液：称取MTT50mg，加入适量PBS（不含钙镁），溶解定容至10mL。

工作液：取9mL细胞培养液3加入1mLMTT储备液，临用现配。

5.4细胞裂解液

十二烷基硫酸钠（SDS）10g

二甲基亚砜（DMSO）99.6mL

冰醋酸0.4mL

6试验方法

6.1细胞培养

LuSens细胞使用细胞培养液1，于37℃、5%CO2培养箱内培养，倒置显微镜下观察细胞状态。细胞达80-90%融合时可用于测试，传代次数不超过20代。

6.2受试物处理

6.2.1溶剂：二甲基亚砜（DMSO）和细胞培养液3。

6.2.2细胞毒性预实验

受试物储备液：采用DMSO为溶剂配制受试物储备液，最大浓度为200mM，不同剂量间比值为2，共设12个浓度。

受试物工作液：采用细胞培养液3将储备液稀释100倍，最终测试浓度分别为0.976、1.953、3.906、7.812、15.625、31.25、62.5、125、250、500、1000、2000μM。若不能得到CV75值，则重复试验降低最大浓度，直到得到CV75值。若2000μM浓度时仍未观察到细胞毒性，则正式试验中使用2000μM为最大浓度。

6.2.3正式试验

受试物储备液：根据预实验结果，用DMSO为溶剂配制受试物储备液，最大浓度为1.2×CV75（或2000μM），不同剂量间比值为1.2，共设6个浓度。

受试物工作液：采用细胞培养液3将储备液稀释100倍，最终测试浓度分别为CV75/2.074、CV75/1.728、CV75/1.44、CV75/1.2、CV75、CV75×1.2μM。

6.3阳性对照溶液

试验前一天，用DMSO配制12mM阳性对照乙二醇二甲基丙烯酸酯（EGDMA）的储存液，试验时用细胞培养液3稀释至检测浓度为120μM。

6.4阴性对照溶液的配制

试验前一天，用DMSO配制500mM阴性对照物DL-乳酸的储存液，试验时用细胞培养液3稀释至检测浓度为5mM。

6.5试验步骤

6.5.1细胞毒性预实验

6.5.1.1细胞接种

细胞生长至融合率80～90%后，弃去培养基，用10mLPBS洗2遍，加入1mL含EDTA的胰酶将细胞消化下来（37℃6～7min），用9mL细胞培养液2重悬，调整细胞浓度为8.3×104个/mL。96孔板中每孔加入120μL细胞液，37℃，5%CO2继续培养24h。

6.5.1.2受试物染毒

试验设置阳性对照组、阴性对照组、受试物组、溶剂对照组、空白对照组（只加细胞培养液3），每组至少3个重复孔。将细胞培养板从培养箱中取出，去除培养基，每孔预先加入150μL细胞培养液3，再依次加入