《生物药物分析与检验》第5章 高效液相色谱法-教学课件（非AI生成）.pptx

高效液相色谱法

授课内容第一节概述第二节基本理论第三节高效液相色谱的定性和定量分析第四节实际操作中的问题第五节在药物分析中的应用

一、起源和发展1903年，俄罗斯科学家Tswett发现色谱分离

第一节概述Tswett实验

1930年以后，相继出现了纸色谱、离子交换色谱和薄层色谱等液相色谱技术。60年代末期出现HPLC。70年代HPLC-MS2004年UPLC

1903年3月21日俄国植物学家茨维特（Michael

Tswett，1872-1919）在华沙自然科学学会生物学会议上发表了“一种新型吸附现象及其在生化分析上的应用”研究论文，介绍了一种应用吸附原理分离植物色素的新方法，并首先认识到这种层析现象在分离分析方面有重大价值。1906年他在德国植物学杂志发表文章，首次命名上述分离后色带为色谱图，称此方法为色谱法（Chromatography）。

高效液相色谱法（highperformanceliquidchromatography；HPLC）是在经典液相色谱法的基础上，引入了气相色谱的理论与高压技术，以高压输送流动相，采用高效固定相及高灵敏度检测器，发展而成的现代液相色谱分离分析方法。二、什么是HPLC

HPLC与经典LC区别

经典LCHPLC仅做为一种分离手段分离和分析柱内径1～3cm，固定相粒径100μm且不均匀柱内径2～6mm，固定相粒径10μm（球形，匀浆装柱）常压输送流动相高压输送流动相柱效低柱效高无法在线检测可以在线检测分析周期长分析时间大大缩短主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段HPLC与经典LC区别

高柱效——远高于一般LC高灵敏度高选择性分析速度快应用范围广泛（可分析80%有机化合物）HPLC的特点和应用

①根据被分析样品的特性选择适用于样品分析的一种高效液相色谱分析方法。②选择一根适用的色谱柱，确定柱的规格（柱内径及柱长）和选用固定相（粒径及孔径）。③选择适当的或优化的分离操作条件，确定流动相的组成、流速及洗脱方式。④由获得的色谱图进行定性分析和定量分析。建立高效液相色谱分析方法

储液瓶高压泵进样器色谱柱检测器废液

溶剂传输系统：心脏样品引入系统：样品分离系统：关键信号检测系统：数据处理系统：高压泵进样器色谱柱检测器软件HPLC系统

1.贮液器：1-2L的玻璃瓶，配有溶剂过滤器(Ni合金)，其孔很约2?m，可防止颗粒物进行泵内。2.脱气：超声波脱气或真空加热脱气。溶剂通过脱气器中的脱气膜，相对分子量小的气体透过膜从溶剂中除去。3.高压泵：对输液泵的要求：密封性好、输液流量稳定无脉动、可调范围宽、耐腐蚀。高压输液系统

要求：输出压力高；平稳、脉冲小；流量稳定可调；耐腐蚀。机械往复柱塞泵结构图

梯度洗脱就是在分离过程中使两种或两种以上不同极性的溶剂按一定程序连续改变它们之间的比例，从而使流动相的强度、极性、pH值或离子强度相应地变化，达到提高分离效果，缩短分析时间的目的。如果只有一个泵，可采用低压混合设计（将两种或以上的溶剂按一定比例混合，再由高压泵输出）；如果有两个或以上泵，调节各自的流量，在高压下混合。梯度淋洗装置

在液相色谱中,可以通过改变流动相的组成、极性来改善分离和调节出峰时间。

通过改变流动相的组成来调整组分的k值，改变分离因子α值，以达到最短时间内得到最佳分离的目的。梯度洗脱梯度洗脱的特点?改善分离,加快分析速度；?改善峰形,减少拖尾;?可能引起基线漂移。

分离和进样系统（一）进样系统HPLC的展宽多因一些柱外因素引起。这些因素包括：进样系统、连接管道及检测器的死体积。进样装置包括两种。1.隔膜注射进样：使用微量注射器进样。装置简单、死体积小。但进样量小且重现性差。

2.高压进样阀：目前最常用的为六通阀。由于进样量可由样品管控制，因此进样准确，重复性好，如图。

六通阀定量环LoadInject通废液口进柱定量环手动进样器-六通阀/定量环

自动进样100样品盘/机器手/自动洗针机械手样品盘自动进样器

柱温箱外挂架色谱柱：柱温箱、色谱柱外挂架

内径：1～6mm，柱长：5～50cm；柱填料粒径：5～10μm为保护色谱柱，通常在柱前加一支填料与色谱柱相同的保护柱。分离系统（色谱柱）

柱性能指标包括在一定条件下（试样、流动相、流速、温度）下的柱压、理论塔板高度H和理论塔板数n、对称因子f、容量因子k和选择性因子的重复性α或分离度R。分析样品时，需检验柱性能是否合乎要求。色谱柱柱效的评价

常用色谱柱柱效评价条件如下：硅胶柱样品：苯、萘、联苯及菲（用己烷配制）；流动相：无水己烷。反相色谱柱（ODS柱等）样品：尿嘧啶（测死时间用）、硝基苯、萘及芴（或甲醇配制的硅胶柱样品）；流动相：甲醇——水（85：15）